截短型PF4慢病毒載體的構建及抗血管新生活性研究.pdf

1、截短型截短型PF4慢病毒載體的構建病毒載體的構建及抗血管新生抗血管新生活性研究活性研究ConstructionofdPlateletFact4LentiviralVectStudyonAntiangiogenesisActivity學科專業(yè)：生物工程研究生：王聽月指導教師：黃鶴副教授企業(yè)導師：王大梅正高級工程師天津大學化工學院二零一五年六月摘要摘要血管新生對于實體瘤的生長與轉移是一個關鍵步驟，抑制腫瘤血管的生成可以達到抑制腫瘤生長的目的

2、，因此以腫瘤血管新生為靶點的治療策略逐漸發(fā)展成為腫瘤治療領域的研究重點。血小板因子4（plateletfact4，PF4）是一種內(nèi)源性抗血管生成因子，它通過多種機制抑制內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，以此抑制血管生成。慢病毒載體作為一種常用且研究較多的基因轉移系統(tǒng)，以其能轉染較難轉染的細胞、組織，將治療基因安全有效的整合到靶細胞基因組中，目的基因表達穩(wěn)定持久、轉移基因容量較大等優(yōu)勢，在基因治療中扮演重要角色。隨著研究的深入，慢病毒載體在腫瘤基因治

3、療方面也取得了很大進展。本課題構建了攜帶截短型血小板因子4片段——PF44770RGD的慢病毒表達載體，將其包裝為活性病毒，并以其介導的PF44770RGD為研究對象，探討其體外抑制血管新生的生物學活性，為抗血管生成基因療法治療腫瘤奠定了基礎。本研究首先將血小板因子4片段PF44770RGD，從保存的載體pcDNA3.1()PF44770RGD上擴增出來，然后將其插入慢病毒表達載體pLVMCSBsd中，構建出慢病毒表達載體pLVPF44

4、770RGD。其次，將構建好的慢病毒表達載體連同慢病毒包裝系統(tǒng)的三個輔助質(zhì)粒，共同轉染293T細胞，進行慢病毒的包裝生產(chǎn)，應用實時熒光定量PCR法（RealtimeQuantitativePCR，QPCR)測定收獲病毒的滴達6.16107IUml。再次，將獲得的空載慢病毒（pLVMCSBsd）和重組慢病毒(pLVPF44770RGD)分別感染人肺腺癌A549細胞系，在殺稻瘟菌素（Blasticidin，Bsd）壓力下篩選出對應的穩(wěn)定表達

5、細胞系，然后在基因水平上通過RTPCR，蛋白水平上通過WesternBlot來檢測PF44770RGD重組肽的表達。最后，進行體外活性實驗，研究重組病毒轉導的PF44770RGD基因功能及感染的A549細胞培養(yǎng)上清中分泌的重組肽的功能，即收集病毒顆粒和穩(wěn)轉PF44770RGD的A549細胞的培養(yǎng)液，用MTT法檢測對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖的作用，并觀察穩(wěn)轉PF44770RGD的A549細胞培養(yǎng)液對HUVEC小管形成的影響。結果