TLR4-PI3K信號通路在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 TLR4對脂多糖誘導的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞分泌IL-1β、 TNF-α的影響
　　目的:研究Toll樣受體-4(Toll like receptors4，TLR4)對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞分泌IL-1β、TNF-α的影響，探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機制中的作用。
　　方法:無菌條件下取大鼠顳下頜

2、關(guān)節(jié)滑膜組織，采用酶消化法獲取原代滑膜細胞進行體外培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并采用免疫熒光細胞化學方法檢測波形蛋白(vimentin)和CD68的表達。以終濃度為0，0.1，1，10，100ng/mL的LPS刺激滑膜成纖維細胞24h，或以LPS(終濃度100ng/mL)刺激細胞0，1，6，12，24h，檢測LPS刺激與IL-1β、TNF-α表達的量效和時效性關(guān)系，選擇最佳的刺激濃度與時間。應(yīng)用LPS刺激細胞，Western

3、 blot檢測TLR4、MyD88的表達變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達情況，應(yīng)用Realtime PCR檢測TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達變化。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細胞后，再加入LPS刺激細胞，應(yīng)用Realtime PCR檢測IL-1β、TNF-α

4、 mRNA的表達變化，采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達情況。
　　結(jié)果:倒置顯微鏡下可見細胞呈梭形，細胞外形均勻一致，具有成纖維細胞的形態(tài)，所有培養(yǎng)的滑膜細胞均對CD68蛋白表達陰性，vimentin表達陽性。證實該細胞是滑膜成纖維細胞。經(jīng)LPS刺激后，IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達量升高，并且隨著LPS刺激濃度的增加而逐漸升高。同時，呈現(xiàn)一定的時間依賴關(guān)系，IL-1β、TNF-α表達量在

5、12h到達高峰，IL-1β、TNF-α mRNA在6h到達高峰。LPS能夠明顯增強TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達，TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導的滑膜成纖維細胞IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達。
　　結(jié)論:TLR4在LPS誘導的滑膜成纖維細胞分泌IL-1β、TNF-α過程中起到重要的調(diào)控作用，特異性抑制劑TAK-242可以有效地抑制LPS誘導的IL-1β、TNF-α mRNA及

6、蛋白的表達。TLR4可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第二部分 TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞分泌IL-1β、TNF-α中的作用研究
　　目的:探討PI3K/Akt信號通路對顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞IL-1β、TNF-α的表達調(diào)控過程，研究TLR4對PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)SFs表達IL-1β、TNF-α的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜細胞，應(yīng)用LPS刺激

7、細胞，Western blot檢測PI3K、Akt、P-PI3K、P-Akt的表達變化，采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達情況，應(yīng)用Realtime PCR檢測IL-1β、TNF-αmRNA的表達變化。用PI3K的特異性抑制劑LY294002預(yù)處理滑膜成纖維細胞后，再加入LPS刺激細胞，應(yīng)用Real time PCR檢測IL-1β、TNF-α mRNA的表達變化，采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、

8、TNF-α的表達情況。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細胞后，再加入LPS刺激細胞，Western blot檢測P-PI3K的表達變化。
　　結(jié)果:經(jīng)LPS刺激后，與對照組相比，P-PI3K、P-Akt、IL-ββ、TNF-α的表達量顯著升高。LY294002的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導的滑膜成纖維細胞IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達。TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導的滑膜成纖維細胞P-PI

9、3K的表達。
　　結(jié)論:PI3K/Akt信號通路在顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞IL-1β、TNF-α的表達調(diào)控過程中起著重要作用。特異性抑制劑LY294002可以有效地抑制LPS誘導的IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白的表達。TLR4對PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)SFs表達IL-1β、TNF-α有著重要作用。PI3K/Akt信號通路可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第三部分 TLR4在調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥

10、反應(yīng)中的作用
　　目的:研究TLR4在調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中的作用，探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機制中的作用。
　　方法:采用四種方法建立顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎動物模型，咬肌切除組:切除大鼠雙側(cè)咬肌;咬合干擾組:右下第一磨牙粘接鑄造金屬冠;咬合升高組:粘接上頜磨牙牙合墊;咬肌切除加咬合升高組:切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊。通過觀察大鼠滑膜組織的病理學改變選擇一種穩(wěn)定而有效的建模方法。建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎模型后，

11、免疫組織化學染色檢測滑膜組織中TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α的表達變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達變化。在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TLR4的特異性抑制劑TAK-242，應(yīng)用HE染色觀察滑膜組織的炎癥反應(yīng)。免疫組織化學染色檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α的表達變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達

12、變化。
　　結(jié)果:HE染色圖片顯示咬肌切除加咬合升高組出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，其病理學評分與其他三個實驗組相比有顯著差異。采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，模型組滑膜組織出現(xiàn)TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的表達升高。TAK-242的應(yīng)用可以緩解滑膜組織的炎癥反應(yīng)，并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相對表達量顯著下降。
　　結(jié)論:TLR4在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中起

13、到重要的調(diào)控作用，特異性抑制劑TAK-242可以有效地抑制滑膜炎發(fā)病過程中出現(xiàn)的IL-ββ、TNF-αmRNA及蛋白的表達。TLR4可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　第四部分TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)中的作用
　　目的:探討PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎中的作用，研究TLR4在PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)過程中的作用及意義。
　　

14、方法:采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，免疫組織化學染色檢測滑膜組織中P-PI3K、P-Akt、IL-1β、TNF-α的表達變化，在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PI3K的特異性抑制劑LY294002，應(yīng)用HE染色觀察滑膜組織的炎癥反應(yīng)變化。免疫組織化學染色檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α的表達變化，應(yīng)用Realtime PCR檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達變化。在大鼠雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射

15、TLR4的特異性抑制劑TAK-242，免疫組織化學染色檢測滑膜組織中P-PI3K的表達變化。
　　結(jié)果:采用切除雙側(cè)咬肌并粘接上頜磨牙牙合墊的方法建立滑膜炎模型，模型組滑膜組織出現(xiàn)P-PI3K、P-Akt蛋白表達升高。LY294002的應(yīng)用可以緩解滑膜組織的炎癥反應(yīng)，并且使IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA的相對表達量顯著下降。TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制滑膜組織P-PI3K的表達。
　　結(jié)論:PI3K/Akt信號通路在