DDAH-ADMA在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及BTM-0512治療機(jī)制研究.pdf

1、第一章 DDAH/ADMA在膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及機(jī)制
　　研究背景:
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的慢性炎癥性的自身免疫系統(tǒng)疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。
　　非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是內(nèi)源性一氧化氮合酶的抑制物，除抑制一氧化氮的生成外，還是一種前致炎因子。二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohyd

2、rolase，DDAH)是ADMA的代謝酶。臨床研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿中ADMA水平顯著升高，且與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性診斷抗體抗瓜氨酸化蛋白抗體呈顯著正相關(guān)，這提示DDAH/ADMA途徑可能參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程。
　　皮質(zhì)抑素(cortistatin，CST)是新的生長(zhǎng)抑素家族成員，具有調(diào)節(jié)免疫與抗炎作用，是目前研究最多的生長(zhǎng)抑素家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，CST能顯著抑制TNF-α生成，并減輕膠原所致關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破壞。

3、本實(shí)驗(yàn)將在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型和原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，研究DDAH/ADMA在膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用，并探討DDAH/ADMA的效應(yīng)是否涉及CST途徑。
　　方法:
　　采用膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與關(guān)節(jié)周徑及病理評(píng)分（蘇木精-伊紅染色法）以評(píng)價(jià)組織損傷。收集大鼠血漿用以檢測(cè)ADMA與炎性因子水平;分離膝關(guān)節(jié)滑膜與右后踝關(guān)節(jié)用以檢測(cè)滑膜組織炎性因子及DDAH與CST的表達(dá)。膠原酶消化法分

4、離大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，原代培養(yǎng)，分別收集細(xì)胞與細(xì)胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿與細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平，高效液相色譜檢測(cè)血漿與細(xì)胞上清液ADMA水平。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)滑膜與細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)滑膜DDAH-2與CST蛋白表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞DDAH-1與DDAH-2蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)細(xì)胞CST表達(dá)。利用

5、GV230工具載體建立過(guò)表達(dá)DDAH-2與過(guò)表達(dá)CST的原代大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，以分析DDAH-2與CST的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠較正常大鼠關(guān)節(jié)紅腫變形，關(guān)節(jié)炎指數(shù)及病理評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組，軟骨及骨質(zhì)破環(huán)，血漿和滑膜組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著升高，滑膜組織DDAH-2表達(dá)顯著下調(diào)，而滑膜組織DDAH-1表達(dá)和血漿ADMA水平則沒(méi)有明顯變化。CST在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠

6、滑膜組織中的表達(dá)也顯著下調(diào)。在原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，TNF-α可時(shí)間依賴性升高細(xì)胞IL-1β、IL-6及ADMA水平并降低DDAH-2與CST表達(dá)，但對(duì)DDAH-1表達(dá)無(wú)明顯作用。外源性ADMA處理也可時(shí)間與劑量依賴性促進(jìn)大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6，并下調(diào)CST表達(dá)。過(guò)表達(dá)DDAH-2能顯著抑制TNF-α促I(mǎi)L-1β、IL-6分泌與下調(diào)CST表達(dá)的作用。過(guò)表達(dá)CST也可以顯著抑制TNF-α促I(mǎi)L-1β、IL-

7、6分泌的作用，但不影響ADMA水平與DDAH-2表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　DDAH/ADMA途徑在膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)中起重要作用;參與炎癥反應(yīng)的DDAH亞型為DDAH-2而非DDAH-1;DDAH/ADMA的效應(yīng)與上調(diào)抗炎因子CST表達(dá)有關(guān)。
　　第二章白藜蘆醇甲基化衍生物BTM-0512抑制膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)及機(jī)制
　　研究背景:
　　白藜蘆醇是一種天然的多酚類(lèi)化合物，具有抗炎，抗氧

8、化等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能減輕膠原所致關(guān)節(jié)腫脹和骨質(zhì)破壞，但其機(jī)制尚未完全明了。
　　(E)-3，5，4'-三甲氧基-1，2-二苯乙烯((E)-3，5，4'-trimethoxystilbene，BTM-0512)為白藜蘆醇甲基化衍生物，其穩(wěn)定性，脂溶性及生物利用度均優(yōu)于白藜蘆醇。文獻(xiàn)報(bào)道BTM-0512對(duì)手術(shù)誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎具有顯著治療作用，但其機(jī)制也未闡明。
　　基于我們第一部分研究證明膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的

9、病理過(guò)程涉及DDAH/ADMA/CST途徑，以及白藜蘆醇和BTM-012能上調(diào)DDAH表達(dá)，降低ADMA水平。本研究將在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型和原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，探討B(tài)TM-0512抑制膠原誘發(fā)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制是否涉及DDAH/ADMA/CST途徑。
　　方法:
　　建立膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。造模成功后分別給予生理鹽水、溶媒（羧甲基纖維素鈉）、BTM-0512低/高劑量（20或60 m

10、g/kg·d）、白藜蘆醇（60 mg/kg·d）及來(lái)氟米特（免疫抑制劑）（6 mg/kg·d）。分別給藥處理30天后，以關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與關(guān)節(jié)周徑及病理評(píng)分（蘇木精-伊紅染色法）評(píng)價(jià)組織損傷。收集大鼠血漿用以檢測(cè)ADMA與炎性因子水平;分離膝關(guān)節(jié)滑膜與右后踝關(guān)節(jié)用以檢測(cè)滑膜組織炎性因子及DDAH與CST的表達(dá)。膠原酶消化法分離大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，原代培養(yǎng)，分別收集細(xì)胞與細(xì)胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿與細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β

11、及IL-6水平，高效液相色譜檢測(cè)血漿與細(xì)胞上清液ADMA水平。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)滑膜與細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)法法檢測(cè)滑膜DDAH-2與CST蛋白表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞DDAH-1與DDAH-2蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)細(xì)胞CST表達(dá)。利用siRNA干擾片段建立DDAH-2基因沉默與CST基因沉默的原代大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，以分析BTM-0512的作用

12、機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠較正常大鼠關(guān)節(jié)紅腫變形，關(guān)節(jié)炎指數(shù)及病理評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組，軟骨及骨質(zhì)破環(huán)，血漿和滑膜組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著升高，滑膜組織DDAH-2的表達(dá)顯著下調(diào)，而滑膜組織DDAH-1表達(dá)和血漿ADMA水平則沒(méi)有明顯變化，滑膜組織CST表達(dá)顯著下調(diào)。BTM-0512可劑量依賴性抑制膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹和病理改變，降低血漿和滑膜TNF-α、IL-1β及IL-

13、6水平，上調(diào)DDAH-2與CST mRNA與蛋白表達(dá)。在原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，BTM-0512能顯著抑制TNF-α促I(mǎi)L-1β、IL-6及ADMA分泌，并減弱TNF-α下調(diào)DDAH-2與CST表達(dá)的作用，但對(duì)DDAH-1表達(dá)無(wú)明顯作用;BTM-0512也能顯著抑制 ADMA促I(mǎi)L-1β、IL-6分泌并下調(diào)CST表達(dá)的作用。DDAH-2基因沉默顯著降低BTM-0512對(duì)TNF-α所致大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。CST基因