eNOS基因轉(zhuǎn)染抑制血管損傷后平滑肌細胞增生的實驗研究.pdf

1、基因治療是將一個有治療作用的基因片段,通過各種載體介導(dǎo),轉(zhuǎn)移至作用部位,使其在局部發(fā)揮作用,從而避免了對全身產(chǎn)生副作用.該實驗通過構(gòu)建含有目的基因eNOS cDNA的真核表達載體pcDNA3.1-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(pcDNA3.1-eNOS),轉(zhuǎn)染血管損傷后大鼠頸總動脈血管平滑肌細胞,觀察其對損傷后血管平滑肌細胞增生的抑制作用.第一部分真核表達載體pcDNA3.1-內(nèi)皮型一氧化氮(pcDNA3.1-eNOS)的構(gòu)建方法:利用限制性內(nèi)切

2、酶EcoR Ⅰ將原核載體pUC13-eNOS酶切并提取其中的eNOS cDNA,與真核載體pcDNA3.1(-)通過EcoR Ⅰ相連接,構(gòu)建成pcDNA3.1-eNOS真核表達載體,并經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及PCR技術(shù)鑒定重組載體是否含有目的基因eNOS cDNA.第二部分大鼠頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型的建立及血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng)方法:(1)制備Wastar大鼠左側(cè)頸總動脈球囊損傷后再狹窄模型,經(jīng)組織病理切片進行HE和Verhoeff

3、鐵蘇木精染色觀察血管再狹窄程度;(2)進行血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng),應(yīng)用抗平滑肌細胞的α-actin抗體鑒定平滑肌細胞.第三部分eNOS基因轉(zhuǎn)染對大鼠球囊損傷后血管平滑肌細胞增殖規(guī)律的影響及對血管再狹窄程度的影響方法:(1)以Fugene 6作為載體將pcDNA3.1-eNOS基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的Wastar大鼠頸總動脈球囊損傷后的血管平滑肌細胞,應(yīng)用RT-PCR、原位雜交及免疫熒光染色方法檢測細胞內(nèi)pcDNA3.1-eNOS基因和eN