菘藍IiFUL和IiSHP2基因的克隆及功能研究.pdf

1、本工作的主要內(nèi)容為菘藍MADS家族基因IiFUL和IiSHP2的克隆與功能研究。首先通過5'-RACE和3'-RACE技術(shù)獲得了IiFUL和IiSHP2基因的cDNA全長序列，然后設(shè)計特異性引物克隆了它們的編碼序列，并進一步構(gòu)建了這兩個基因的過表達載體和GFP亞細(xì)胞定位載體。將重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404菌株中并侵染野生型Col-0擬南芥植株與秦?zé)?5葉片，經(jīng)抗生素篩選后獲得了轉(zhuǎn)基因植株。本研究主要針對IiFUL轉(zhuǎn)基因植株不同部位

2、的表型特征進行了觀察，確定了IiFUL基因在植株生殖生長階段可能具有的功能。同時，本研究還采用實時定量PCR和原位雜交技術(shù)檢測了IiFUL和IiSHP基因在菘藍不同組織中的表達水平。根據(jù)IiFUL和IiSHP2基因在菘藍短角果不同發(fā)育階段以及不同結(jié)構(gòu)中的表達情況，分析了這兩個基因與果實不開裂表型之間的關(guān)系。
　　通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對發(fā)現(xiàn)，IiFUL和IiSHP2基因與擬南芥AtFUL和AtSHP2基因高度同源，核苷酸

3、序列一致性分別達到了93％和89％。IiFUL和IiSHP2具有典型的MADS家族MIKC型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，與擬南芥AtFUL和AtSHP2在MADS-box結(jié)構(gòu)域位置的一致性達到了100％，整個氨基酸序列的一致性分別為95.06％和93.17％。
　　對IiFUL過表達擬南芥植株進行觀察發(fā)現(xiàn)，該植株出現(xiàn)了異常的表型變化，特別是在進入生殖生長階段后的改變尤為明顯。與野生型相比，IiFUL轉(zhuǎn)基因擬南芥植株明顯早花，但主莖頂端花序分生組

4、織的活躍性大幅降低，頂端花數(shù)量減少。頂端花在發(fā)育過程中產(chǎn)生了很多變異的表型，主要包括雌蕊異常膨大，花瓣和雄蕊萎縮或數(shù)目發(fā)生改變，萼片端部和內(nèi)部出現(xiàn)柱頭狀組織以及裸露的胚珠。此外，頂端花還出現(xiàn)了花中花結(jié)構(gòu)。這些觀察結(jié)果說明，IiFUL可以影響花序分生組織和雌蕊的形成過程，它的異位表達會干擾頂端花序、花萼、花瓣和雄蕊的正常發(fā)育。過表達IiFUL基因以后，擬南芥?zhèn)壬ㄐ虍a(chǎn)生的可育角果出現(xiàn)了不開裂的表型，這種表型是由于果皮與胚座框之間的開裂區(qū)無

5、法正常形成而造成的。此外，IiFUL基因還與葉片形態(tài)發(fā)生有關(guān)，它的組成性表達能夠改變擬南芥莖生葉的形狀和煙草葉片的長寬比。
　　實時定量PCR結(jié)果顯示，IiFUL和IiSHP2基因在花和果莢中的表達量較高，說明它們在功能上與菘藍的開花和果莢形成過程有關(guān)。在果莢中，IiFUL基因主要在果皮與果翅中表達，它可能負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)果莢外部結(jié)構(gòu)的形成;相反，IiSHP2基因主要在種子中表達，它可能參與胚珠與種子的發(fā)育過程。原位雜交實驗結(jié)果顯示，Ii

6、FUL基因能夠在菘藍植株的早期頂端花序中表達，在側(cè)生花序中也能夠檢測到該基因的活性，但是在花分生組織以及早期花蕾中幾乎檢測不到IiFUL基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說明IiFUL基因主要在生殖生長階段的早期發(fā)揮作用。原位雜交實驗結(jié)果表明，IiFUL基因的表達出現(xiàn)在果皮與果翅外層細(xì)胞中，而IiSHP2基因在這些部位處于被抑制狀態(tài)。結(jié)合之前文獻中對擬南芥角果呈現(xiàn)開裂表型的研究報道，以及IiFUL轉(zhuǎn)基因擬南芥產(chǎn)生的角果不開裂這一事實，可以推測IiFUL基