FK506抑制鈣神經(jīng)素改善學(xué)習(xí)記憶和減輕腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的研究.pdf

1、本研究通過建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)對局灶性腦組織水腫進(jìn)行相關(guān)檢測，檢測鈣神經(jīng)素及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，同時(shí)觀察FK506的影響，進(jìn)一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后學(xué)習(xí)記憶障礙、局部腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生中的作用，并探討其可能機(jī)制。為癲癇發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究和臨床治療提供新的思路。
　　本研究分為兩個(gè)部分:
　　第一部分:氯化鋰一匹魯卡品癲癇大鼠模型的建立、病理觀

2、察及FK506對癲癇大鼠行為學(xué)、學(xué)習(xí)記憶能力的作用
　　目的:
　　本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，觀察大鼠行為學(xué)變化，并對大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行進(jìn)一步的病理學(xué)觀察。同時(shí)觀察FK506對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討FK506在癲癇大鼠模型中的具體作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品，建立大鼠氯化鋰-匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，分別為正常對照組

3、，癲癇組(pilo組)，F(xiàn)K506組。
　　2.根據(jù)Racine分級，分別記錄大鼠癲癇發(fā)作的程度分級，發(fā)作潛伏期，癲癇發(fā)作起止時(shí)間。
　　3.應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察致癇大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的變化，并觀察FK506對大鼠認(rèn)知功能的影響。
　　4.光鏡HE染色觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作后12d海馬神經(jīng)元的變化，包括形態(tài)及數(shù)目的改變，同時(shí)觀察FK506對其的影響。
　　結(jié)果:
　　1.癲癇組和Fk506組大鼠腹

4、腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作，開始較輕，發(fā)作程度逐漸加重，后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強(qiáng)度的變化。與癲癇組相比，F(xiàn)k506組大鼠的潛伏期延長，發(fā)作的強(qiáng)度級別降低。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。
　　2.通過水迷宮試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，癲癇組潛伏期較對照組明顯延長，于目標(biāo)象限內(nèi)的游泳距離縮短，次數(shù)減少，提示其存在明顯認(rèn)知功能障礙。K506組大鼠在水迷宮中的潛伏期較癲癇組縮短，可見于目標(biāo)象限內(nèi)的游泳距離延長，于目

5、標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間增加，穿過原平臺位置的次數(shù)增多。提示FK506能改善癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　3.光鏡下對照組大鼠海馬未見損害性改變，HE染色示CA3區(qū)錐體神經(jīng)元排列緊密、整齊，分布呈現(xiàn)帶狀，可見清晰完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，胞漿透明，可見圓形或橢圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，形態(tài)正常。SE后12d時(shí)癲癇組大鼠的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度變性、死亡，排列紊亂，數(shù)目減少，部分神經(jīng)元形態(tài)不完整，胞體腫脹、變形、破裂，

6、輪廓模糊、界限不清，壞死的神經(jīng)元胞漿皺縮，紅染，核碎裂甚至消失，失去正常結(jié)構(gòu)，伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生;與對照組相比，F(xiàn)K506組神經(jīng)元也有丟失，數(shù)目減少，但與癲癇組比較，存活神經(jīng)元明顯增多，海馬損傷明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.氯化鋰—匹魯卡品可成功誘導(dǎo)Wistar大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作，同時(shí)操作簡單，造模成功率高，可作為癲癇發(fā)病機(jī)制的理想模型，可為新型抗癲癇藥物提供理論依據(jù)。
　　2.癲癇組和Fk506組大鼠腹腔注射匹魯卡

7、品后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。Fk506組大鼠的潛伏期延長，發(fā)作的強(qiáng)度級別降低。提示FK506的抗癲癇作用。
　　3.匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)動(dòng)物模型，其學(xué)習(xí)和空間記憶能力受損。應(yīng)用FK506后可使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，提示FK506對大鼠記憶學(xué)習(xí)能力的保護(hù)作用。
　　4.氯化鋰—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬病理學(xué)觀察可見神經(jīng)元損傷性改變，神經(jīng)元數(shù)量減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷模糊及核固縮等改變，F(xiàn)K506組大鼠海馬損傷明顯減輕。提示

8、FK506的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分:FK506抑制鈣神經(jīng)素減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)小鼠腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的研究
　　目的:
　　本研究建立氯化鋰一匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，觀察行為學(xué)變化，核磁共振對局灶性腦組織掃描觀察腦水腫變化，測定腦組織水含量，測定鈣神經(jīng)素及GFAP的表達(dá)，同時(shí)觀察免疫抑制劑FK506對腦組織水腫及鈣神經(jīng)素，GFAP表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究鈣神經(jīng)素在癲癇后局部腦水腫及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生中的作用，

9、并探討其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品建立小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。隨即將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組，為正常對照組，癲癇組，雷帕霉素組，F(xiàn)K506組。
　　2.根據(jù)Racine分級，分別記錄小鼠癲癇發(fā)作的程度分級，發(fā)作潛伏期，癲癇發(fā)作起止時(shí)間。
　　3.應(yīng)用核磁共振技術(shù)對小鼠腦組織掃描，觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)局部腦組織水腫情況。
　　4.應(yīng)用濕—干重法，檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織的水

10、含量。
　　5.通過免疫組織化學(xué)染色，觀察癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬神經(jīng)元GFAP的表達(dá)，進(jìn)而反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生。
　　6.應(yīng)用Western Blot方法，測定癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后小鼠海馬組織鈣神經(jīng)素(CaN)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.癲癇組、Fk506組小鼠腹腔注射匹魯卡品后出現(xiàn)癲癇發(fā)作，開始較輕，發(fā)作程度逐漸加重，后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。記錄各組的潛伏期和發(fā)作強(qiáng)度的變化。與癲癇組相比，F(xiàn)k506組

11、小鼠的潛伏期、發(fā)作的強(qiáng)度級別無明顯差異。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水后未觀察到癲癇發(fā)作。
　　2.通過對各組小鼠在癲癇發(fā)作后的不同時(shí)間點(diǎn)行核磁共振檢查，結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h可見局部腦組織T2像高信號，提示局部腦組織水腫明顯，癲癇持續(xù)狀態(tài)后7d時(shí)局部腦組織T2像信號明顯減低，提示腦水腫明顯減輕。FK506可顯著減輕24h時(shí)局部的腦水腫，雷帕霉素未見明顯的抑制作用。
　　3.腦組織的水含量測定顯示癲癇組，F(xiàn)K506組及雷帕

12、霉素組小鼠的腦組織含水量在癲癇發(fā)作后24h時(shí)明顯升高，7d時(shí)各組小鼠的腦組織含水量恢復(fù)到正常水平。與癲癇組小鼠相比，F(xiàn)K506組小鼠在24h時(shí)的腦組織含水量降低，而雷帕霉素組小鼠未顯示出明顯差異。
　　4.通過Western blot測定癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h，72h及7d時(shí)腦組織鈣神經(jīng)素的表達(dá)。結(jié)果提示，鈣神經(jīng)素在癲癇發(fā)作后24h顯著增加，一直持續(xù)到7d。結(jié)果提示腦組織的水腫與鈣神經(jīng)素的表達(dá)有關(guān)。
　　5.通過免疫組化方法檢

13、測GFAP的表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體的GFAP是一種細(xì)胞骨架蛋白，可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的狀態(tài)，是其特征性的蛋白標(biāo)志，同時(shí)可以特異性的對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果表明，在癲癇發(fā)作后72h時(shí)GFAP表達(dá)增加，7d時(shí)更加明顯。CaN抑制劑FK506可以抑制GFAP的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。雷帕霉素組在癲癇后7d時(shí)GFAP表達(dá)比癲癇組低，但比FK506組高，雷帕霉素對GFAP的抑制作用要弱于FK506。結(jié)果表明鈣神經(jīng)素在癲癇后星形膠質(zhì)細(xì)胞活

14、化中的作用，F(xiàn)K506可通過抑制鈣神經(jīng)素的表達(dá)，發(fā)揮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用。
　　結(jié)論:
　　1.通過核磁共振掃描及腦組織含水量檢測，癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦組織出現(xiàn)明顯腦水腫，發(fā)作后7d時(shí)水腫明顯減輕。FK506可減輕癲癇后腦組織的水腫，發(fā)揮腦保護(hù)作用，雷帕霉素未見明顯的保護(hù)作用。
　　2.癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后腦組織鈣神經(jīng)素的表達(dá)在24h顯著增加，一直持續(xù)到7d。CaN抑制劑FK506可顯著減輕24h時(shí)局部的腦水腫，雷帕霉