FK506對(duì)中期保存離體角膜作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：隨著器官移植技術(shù)的發(fā)展，離體器官的保存也越來(lái)越受到重視，離體器官的保存質(zhì)量直接影響移植后器官的成活率及其成活后的功能，器官保存技術(shù)是近幾十年的研究熱點(diǎn)之一。 研究證明離體器官損傷有多種機(jī)制參與，如氧自由基損傷、基因調(diào)控的細(xì)胞凋亡等。有研究證明在器官保存液中加入氧自由基清除劑或抑制氧自由基生成的物質(zhì)，或明顯提高離體器官的存活時(shí)間，提高移植成功率，降低缺血再灌注損傷。 FK506是一種從霉菌中分離的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，也

2、是一種新合成的高效器官移植免疫劑。據(jù)研究報(bào)道，F(xiàn)K506可增強(qiáng)組織低溫保存再灌注的血流，增加組織ATP含量，可減少再灌注組織中的氧自由基含量，減低細(xì)胞因子和釋放和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，從而減輕組織損傷。也有研究證明利用FK506預(yù)處理移植物，可明顯降低移植物凋亡率，保護(hù)組織細(xì)胞線粒體，其機(jī)理仍在研究中。 角膜移植手術(shù)是目前最常見(jiàn)，成功率最高的器官移植手術(shù)，但免疫排斥反應(yīng)依就是角膜移植失敗的主要原因

3、。臨床上目前采用的皮質(zhì)類固醇，環(huán)孢霉素A、絲裂霉素C等免疫抑制劑等，可以有效地防治免疫排斥反應(yīng)。FK506目前已廣泛用于各種器官移植及各類自身免疫性疾病的治療，在抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)方面有廣泛的應(yīng)用。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506在離體器官的保存方面也有重要的保護(hù)作用，可以明顯降低離體器官細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)離體器官保存時(shí)間，但FK506在離體角膜的保存的保護(hù)作用及其機(jī)制國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。 BCL-2基因是目前最受關(guān)注的并被確認(rèn)的的調(diào)亡抵

4、制基因，其基因產(chǎn)物通過(guò)抵抗線粒體釋放促凋亡蛋白、維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定、對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及抑制富含胱氨酸蛋白酶的激活等作用抑制細(xì)胞的凋亡。BCL-2富含于線粒體膜上，具有維護(hù)線粒體膜的完整性及生理通透性的重要作用，對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。@ 本研究對(duì)FK506對(duì)離體角膜的保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行探索，并通過(guò)BCL-2蛋白的表達(dá)情況對(duì)FK506對(duì)離體角膜保護(hù)的機(jī)理進(jìn)行研究。 目的：探討FK506在中期角膜保存過(guò)程中對(duì)角膜細(xì)胞形態(tài)

5、的影響，以減少角膜保存過(guò)程中保存角膜細(xì)胞的價(jià)值，為改良角膜保存液，延長(zhǎng)離體角膜保存時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 研究以免疫組織化學(xué)染色法觀察BCL-2蛋白在離體角膜組織的表達(dá)，研究FK506對(duì)離體角膜保護(hù)的機(jī)理。 方法：收集質(zhì)量相近身體健康的新西蘭大白兔24只，耳緣靜脈栓塞致死，完整取下眼球，每只兔的右眼做為試驗(yàn)組共24只置于4℃冰箱保存的，由山東省眼科研究所生產(chǎn)的角膜保存液中，每只兔的左眼共24只做為對(duì)照組置于同樣的、同時(shí)生產(chǎn)

6、的角膜保存液中，實(shí)驗(yàn)組中保存液含有0.3mg/L濃度的FK506。 分別于4、6、8天每組隨機(jī)取4只眼球并取帶2mm鞏膜環(huán)的角膜片，經(jīng)30-34℃2h復(fù)溫，固定切片，置預(yù)冷的10％福爾馬林液中固定，石蠟包埋，行角膜切片，切片厚4μm, HE染色。觀察細(xì)胞形態(tài)。 于4、6、8天每組隨機(jī)抽取4只眼球并取帶2mm鞏膜環(huán)的角膜片分別行半定量RT-PCR法觀察BCL-2 mRNA表達(dá)水平和S-P免疫組化法觀察角膜細(xì)胞BCL-2蛋白

7、的表達(dá)水平。BCL-2蛋白免疫組化以顯微鏡下胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞：將染色分為4級(jí)：0=陰性染色、1=弱陽(yáng)性染色、2：中度陽(yáng)性染色、3=強(qiáng)陽(yáng)性染色，將各組染色分級(jí)量化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組BCL-2蛋白表達(dá)差異用單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：HE染色試驗(yàn)組較對(duì)照組保存角膜水腫較輕，被褶較少透明度較高，角膜細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)較好。 半定量RT-PCR法檢測(cè)BCL-2 mRNA表達(dá)，4天試驗(yàn)組BCL-2mRN

8、A表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異．(P>0.05)；6天試驗(yàn)組、BCL-2 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；8天試驗(yàn)組BCL-2 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 免疫組化測(cè)定角膜內(nèi)皮細(xì)胞BCL-2蛋白的表達(dá)，BCL-2蛋白免疫組化以顯微鏡下胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，4天試驗(yàn)組BCL-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；6天試驗(yàn)組BCL-2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組的有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)