TIZ與卵巢癌關(guān)系的基因水平研究.pdf

1、卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤，死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中居首位，并有上升趨勢。因卵巢生理解剖位置處于盆腔深部，早期卵巢癌患者缺乏典型的臨床癥狀，大部分卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時病變已發(fā)展到晚期。因此在分子生物學(xué)水平研究卵巢癌變機(jī)理及惡性生物學(xué)行為，尋找早期診斷方法，探索有效的治療手段，對于改善患者的預(yù)后，提高的生存率，降低死亡率有重要意義。本實(shí)驗室前期應(yīng)用SEREX技術(shù)從血清中篩選出卵巢癌相關(guān)抗原TIZ，TIZ蛋白在卵巢癌患者血清表達(dá)

2、升高，TIZ蛋白聯(lián)合其它血清標(biāo)志物有助于提高診斷的敏感性和特異性。為了從基因水平進(jìn)一步了解TIZ與卵巢癌的關(guān)系，本實(shí)驗通過RT-PCR方法檢測不同卵巢組織里TIZ基因的表達(dá)情況、構(gòu)建TIZ基因真核表達(dá)載體及RNA干擾等實(shí)驗，研究TIZ與卵巢癌的關(guān)系及TIZ對卵巢癌細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響。 目的：探討TIZ基因在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法：采用RT-PCR技術(shù)檢測48例卵巢惡性腫瘤、22例卵巢良性腫瘤及2

3、4例正常卵巢組織TIZmRNA的表達(dá)情況，分析TIZ基因與卵巢癌的關(guān)系。 結(jié)果：(1)TIZmRNA在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織、卵巢惡性腫瘤組織中均有表達(dá)。TIZmRNA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)較正常卵巢組織低(p<0.05)，TIZmRNA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)較卵巢良性腫瘤組織低(p<0.05)；(2)TIZ基因表達(dá)與卵巢癌患者組織學(xué)類型，病理分級等臨床病理特征及預(yù)后無關(guān)(p>0.05)。結(jié)論：TIZmRNA在卵

4、巢惡性腫瘤組織中表達(dá)降低。TIZ基因與抑癌基因作用相同，有抑制卵巢癌的發(fā)生的作用。 目的：通過基因工程技術(shù)，擴(kuò)增出TIZ基因全長，構(gòu)建其真核表達(dá)載體。為進(jìn)一步研究TIZ與卵巢癌的關(guān)系打下基礎(chǔ)。 方法：選取漿液性卵巢癌組織作為模板，提取人卵巢癌組織總mRNA，利用PCR技術(shù)進(jìn)行TIZ基因全長的擴(kuò)增。將其與真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接，將連接載體進(jìn)行酶切和測序鑒定。 結(jié)果：成功擴(kuò)增出TIZ基因全長，并經(jīng)測序驗證其同源性

5、達(dá)99％，測序結(jié)果顯示第1551位的T突變成C，但其編碼氨基酸并不改變，屬無意義突變，可以用于后續(xù)實(shí)驗研究。 結(jié)論：成功從惡性卵巢癌組織中擴(kuò)增出TIZ基因全長并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TIZ。 目的：了解TIZ基因?qū)β殉舶┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響，分析TIZ在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用；探索其作為早期診斷、治療靶向的價值。 方法：成功構(gòu)建TIZ基因真核表達(dá)載體后，將其轉(zhuǎn)染入無TIZ基因表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株H

6、08910，G418篩選后經(jīng)RT-PCR鑒定，確認(rèn)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H08910/pcDNA3.1-TIZ細(xì)胞株。然后進(jìn)行細(xì)胞生長特性、細(xì)胞周期變化、克隆形成能力、細(xì)胞遷移能力、黏附能力、細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗。 結(jié)果：通過轉(zhuǎn)染篩選，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)TIZ蛋白的卵巢癌細(xì)胞株。生長曲線顯示轉(zhuǎn)染了TIZ基因的卵巢癌細(xì)胞株生長速度減慢。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞檢測結(jié)果顯示H08910/pcDNA3.1-TIZ組處于增殖狀態(tài)(S+G2+M)的細(xì)胞為32

7、.6％，G1期為67.4％，對照組則相應(yīng)為60.7％和39.3％，其處于增殖周期的細(xì)胞減少。兩組的克隆形成率、遷移能力、黏附能力侵、襲能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論：細(xì)胞功能實(shí)驗結(jié)果表明，TIZ能夠抑制卵巢癌H08910細(xì)胞的生長能力，對其遷移、侵襲、粘附能力均無影響。 目的：通過構(gòu)建人TIZ基因的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞。繼而篩選出穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株，進(jìn)行一系列功能實(shí)驗。 方法：針對TIZ

8、mRNA的不同區(qū)域設(shè)計三組不同的siRNA片段，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染TIZ高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，實(shí)時熒光定量PCR檢驗干擾效率，選擇干擾效率最高的siRNA片段構(gòu)建干擾載體。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染TIZ基因高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3并進(jìn)行G418抗性篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，RT-PCR檢驗TIZ基因受抑制情況，然后進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗。 結(jié)果：用熒光定量PCR對不同siRNA干擾片段的干擾效果進(jìn)行檢測結(jié)果顯示，TIZ-573組相對拷貝

9、數(shù)為0.844±0.756，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。TIZ-573組抑制率最高，其抑制率為61％。構(gòu)建干擾載體pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，獲得穩(wěn)定干擾表達(dá)株SKOV3/pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573，RT-PCR檢驗其TIZmRNA表達(dá)明顯減少。生長曲線顯示pGPU6/GFP/Neo-TI2-573組比對照組的細(xì)胞生長快。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞檢測結(jié)果顯示pGPU