MMP-9-TIMP-1、RANTES在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及地塞米松干預(yù)的影響.pdf

1、背景:支氣管哮喘(Bronchial Asthma)簡稱哮喘,是兒童期最常見的慢性呼吸道疾病,是由多種細胞如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞等參與的慢性氣道炎癥,臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息,呼吸困難、胸悶或咳嗽,全球哮喘患病率呈上升趨勢。持續(xù)氣道炎癥使氣道反復(fù)損傷、修復(fù),將導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)變化即發(fā)生氣道重塑,主要表現(xiàn)為平滑肌細胞增生肥大,上皮下膠原沉積,杯狀細胞增生,新血管生成等。其中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,E

2、CM)在氣管上皮下的異常沉積是哮喘特征性病理改變。金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)為調(diào)節(jié)ECM代謝的主要限速酶,可降解ECM的大多數(shù)成分。金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)-1可1:1與MMP-9結(jié)合,特異性抑制MMP-9的活性。MMP-9/TIMP-1失衡導(dǎo)致細胞外基質(zhì)代謝異常,可能參與哮喘氣道重塑過程。正常T細胞

3、表達和分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)屬于半胱氨酸-半胱氨酸(Cys-Cys,CC)類趨化因子,又稱CCL5,由多種炎性細胞分泌,它對嗜酸性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、NK細胞等有趨化作用,尤其是對嗜酸性粒細胞強大的趨化作用,可加重哮喘氣道炎癥,參與氣道重塑的發(fā)生。
　　 目的:通過光鏡觀察

4、實驗大鼠氣道病理變化,計算機圖像分析軟件量化氣道壁增厚情況,了解哮喘氣道重塑情況;
　　 檢測大鼠氣道MMP-9、TIMP-1及肺泡灌沈液RANTES的表達水平,探討MMP-9/TIMP-1在哮喘氣道重塑中的作用,分析MMP-9/TIMP-1與RANTES的相關(guān)性。
　　 方法:按照完全隨機分組法,將36只雄性Wister大鼠分為哮喘模型組(A組)、地塞米松干預(yù)組(B組)、正常對照組(C組)三組。采用卵白蛋白(Ovalb

5、umin,OVA)和氫氧化鋁的復(fù)合制劑致敏、OVA激發(fā)方法。第1、7、14天,A、B組大鼠分別給予腹腔注射10％卵白蛋白與氫氧化鋁混懸液1ml/只致敏,C組則相應(yīng)給予腹腔注射生理鹽水1ml/只。第21天A、B組開始霧化吸入1％的卵白蛋白激發(fā)喘息發(fā)作,每次霧化吸入30分鐘,隔天1次,共6周,C組霧化吸入0.9％生理鹽水作為對照。B組自霧化激發(fā)后1周起霧化前半小時予尾靜脈注射地塞米松0.5mg/Kg每周3次,共5周,A、C組對應(yīng)給予0.9％

6、生理鹽水0.5ml尾靜脈注射。三組大鼠均于末次霧化吸入后24小時進行1％戊巴比妥鈉0.2ml/Kg腹腔注射麻醉開胸,結(jié)扎左肺取肺組織固定、包埋;行氣管插管,用生理鹽水5ml沖洗5次回收右肺肺泡灌洗液,1000轉(zhuǎn)低溫離心5分鐘,取上清。
　　 制作左肺組織的HE染色切片,光鏡觀察各組切片中氣道的病理學變化,多功能彩色病理圖像分析儀測量切片中支氣管橫截面的基底膜周徑(bronchial basement membrane perim

7、eter,Pbm),氣道平滑肌面積(airwaysmooth muscle area,Wam),氣道內(nèi)壁面積(inner way area,Wai),以Wam/Pbm和Wai/Pbm作為氣道重塑指標;將左肺組織切片用免疫組化方法標記MMP-9、TIMP-1,并應(yīng)用多功能彩色病理圖像分析儀測定MMP-9、TIMP-1積分光密度(integral optical density,IOD);雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測右側(cè)肺泡

8、灌沈液RANTES水平。
　　 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件,對組間Wam/Pbm和Wai/Pbm、MMP-9和TIMP-1數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義,將MMP-9/TIMP-1與RANTES做相關(guān)性分析,計算相關(guān)系數(shù)r,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:哮喘模型組致敏的大鼠,在霧化OVA時均出現(xiàn)喘息發(fā)作,霧化6周后,大鼠左肺支氣管HE染色的病理切片中出現(xiàn)平滑肌、管壁增厚的重構(gòu)現(xiàn)象,檢測

9、切片中氣道平滑肌面積/基底膜周徑(Wam/Pbm)和氣道內(nèi)壁面積/基底膜周徑(Wai/Pbm)分別為5.78±1.36μm2/μm,15.10±3.99μm2/μm較正常對照組明顯增大(P＜0.05)。地塞米松干預(yù)組在第一周霧化OVA即出現(xiàn)喘息發(fā)作,在第二周應(yīng)用地塞米松后喘息減輕,霧化6周后,其左肺支氣管HE染色切片中氣道重塑現(xiàn)象不明顯,測量氣道管壁Wam/Pbm和Wai/Pbm為3.98±1.25μm2/μm,9.86±2.47μm2

10、/μm,較哮喘模型組氣道為輕(P＜0.05)。
　　 哮喘模型組大鼠左肺組織中MMP-9和TIMP-1的平均積分光密度(IOD)(1.7655±1.0476,1.958±0.0927)及右肺肺泡灌洗液RANTES表達水平(18.20±4.00pg/ml)明顯高于正常對照組、地塞米松干預(yù)組(P＜0.05),地塞米松干預(yù)組MMP-9和TIMP-1的平均IOD(0.8525±0.0231,0.876±0.0302)及肺泡灌洗液中RAN

11、TES水平(9.28±2.26 pg/ml)與正常對照組無明顯差別(P＞0.05)。MMP-9/TIMP-1在哮喘模型比例失衡,與肺泡灌洗液RANTES水平呈負相關(guān)(r=-0.141,P＜0.05)。
　　 結(jié)論:哮喘時MMP-9、TIMP-1及RANTES的表達水平均提高,可能有加重氣道炎癥的作用;哮喘時MMP-9/TIMP-1比例失調(diào),與炎性細胞趨化因子RANTES水平呈負相關(guān),與ECM的降解與沉積有關(guān),參與氣道重塑的發(fā)生;