兔緩慢性心律失常模型建立與MSCs同種異體心臟移植后細胞整合及功能研究.pdf

1、研究背景與目的：病態(tài)竇房結(jié)綜合征(病竇綜合征)是一種常見臨床疾病，該疾病對人類健康危害很大。目前，關(guān)于病竇綜合征的發(fā)病機理可能有以下幾種：1)退行性變；2)心肌?。?)心肌炎癥；4)手術(shù)損傷等，植入永久性人工電子心臟起搏器仍然是目前臨床上主要的治療手段。電子心臟起搏器有一些固有缺陷，如：電池壽命有限、需要定期檢測及更換，價格昂貴，可能發(fā)生電極斷裂及全身嚴重感染等并發(fā)癥。因此，探討如何建立一個具有正常生理起搏功能的“生物起搏器”替代竇房結(jié)

2、或者其他傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞發(fā)揮功能，從而避免永久性人工電子心臟起搏器植入，已經(jīng)成為目前心臟電生理學(xué)界研究的重點及熱點內(nèi)容之一，部分學(xué)者在以基因治療和細胞移植技術(shù)為平臺構(gòu)建心臟生物起搏器治療緩慢性心律失常方面進行了不少有益的探索。部分研究將骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)經(jīng)基因修飾后移植或者直接移植、胚胎干細胞(embryonic stem cells)體外誘導(dǎo)分化為起搏細胞進行移植或者成體心肌細胞直接

3、移植至生物體內(nèi)試圖建立新的心臟起搏點，但其結(jié)果并不十分理想，其主要問題包括：1)胚胎干細胞的倫理學(xué)問題；2)干細胞誘導(dǎo)分化技術(shù)不成熟；3)心率偏慢、移植細胞體內(nèi)存活時間不確定以及較低的心率變異性；4)成體心肌細胞來源比較困難等。
　　 超極化激活的環(huán)核苷酸門控的陽離子通道(hyperpolarization activated cyclicnucleotide gated cation channel，HCN)基因是起搏離子流(

4、funny current，If)的分子基礎(chǔ)；HCN基因家族四個成員HCN1～HCN4中HCN4基因與If的形成關(guān)系最為密切。近年來的研究已經(jīng)證實起搏電流If在調(diào)控心臟和神經(jīng)元的自發(fā)起搏活動中起著非常重要的作用。目前正在進行的以基因治療和細胞移植技術(shù)為平臺構(gòu)建心臟生物起搏器治療緩慢性心律失常的研究中，HCN通道基因已成為備受重視的備選基因。在已克隆的4種HCN基因亞型中，HCN4主要分布于心臟的特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)組織中。既往研究均選用大型實驗

5、動物犬/豬，采用射頻消融法獲得永久性三度房室傳導(dǎo)阻滯模型，所選靶基因多為HCN2基因，本研究旨在探討經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)的基礎(chǔ)上行雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激制備一過性兔緩慢性心律失常模型，觀察mHCN4基因修飾的兔骨髓間充質(zhì)干細胞移植至兔左室游離壁心外膜下之后的在體整合及起搏功能情況，為探討與完善生物起搏治療提供新的研究思路與方法。
　　 方法：
　　 1.取2月齡日本大耳白兔無菌條件下行股骨粗隆穿刺抽取骨髓，采用Percoll梯度密

6、度離心法洗滌離心2遍后，收集中間層呈云霧狀白膜的單個核細胞層，用DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，加入胎牛血清(10％)的DMEM培養(yǎng)基中按照10×108/ml常規(guī)行接種、培養(yǎng)及傳代。選取生長狀態(tài)良好的第4代兔MSCs細胞按2×104/孔的接種密度接種于24孔板中，將培養(yǎng)基與含有pMSCV-mHCN4-EGFP的病毒上清按1:1比例稀釋后加入鋪板的兔MSCs細胞中，并加入polybrene(終濃度調(diào)至2μg/ml)。轉(zhuǎn)染24 h后，用2μg/ml

7、的嘌呤霉素加壓篩選培養(yǎng)10～15天，即可獲得mHCN4感染陽性的兔MSCs。免疫熒光法檢測空白對照、EGFP組及mHCN4組細胞目的基因表達情況。以膜片鉗技術(shù)對轉(zhuǎn)染表達的mHCN4通道進行電生理學(xué)測定。
　　 2.采用化學(xué)消融兔竇房結(jié)的基礎(chǔ)上雙側(cè)迷走神經(jīng)程序刺激法制備一過性緩慢性心律失常模型。化學(xué)消融方案：以干棉簽拭干右心耳和上腔靜脈交界處區(qū)域(即SAN區(qū))，用大小約5 mm×5 mm×5 mm棉簽蘸取20％的甲醛溶液置于SAN

8、區(qū)濕敷。動態(tài)監(jiān)測ECG變化情況并記錄HR變化，以濕敷后HR下降超過30％或者出現(xiàn)交界性逸搏、竇性停搏為消融成功標準，停止?jié)穹螅掷m(xù)監(jiān)測ECG至少2 h，如ECG顯示心率/節(jié)律出現(xiàn)反復(fù)，則再次行甲醛濕敷直至達標為止。迷走刺激方案：采用頻率分級遞增法進行單/雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激。選取刺激電壓4～6V，刺激頻率依次為：2.5Hz、5Hz、10Hz、15Hz以及20Hz(1Hz=60次/分)。先行2.5Hz刺激，時間不超過60s，經(jīng)刺激達到刺激終點

9、時對觀察指標進行記錄；如刺激60s仍沒有達到刺激終點，則增加刺激頻率進入下一檔刺激。兩次刺激間隔時間不少于180s。以此類推。達到刺激終點的實驗兔在間隔180s后行120s持續(xù)刺激。
　　 3.移植后3天、1周、2周及4周分別于麻醉下化學(xué)消融竇房結(jié)后程序刺激雙側(cè)迷走神經(jīng)，觀察有無左室移植細胞來源的早搏或室性節(jié)律。術(shù)后取材行HE染色觀察細胞形態(tài)，DAB顯色檢測縫隙連接蛋白表達，免疫熒光檢測EGFP及mHCN4基因表達。
　　

10、 結(jié)果：
　　 1.成功將攜帶mHCN4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉(zhuǎn)染至兔MSCs，經(jīng)2μg/mL的嘌呤霉素加壓篩選后獲得了可穩(wěn)定表達mHCN4基因的兔MSCs。
　　 2.轉(zhuǎn)染mHCN4基因的兔MSCs可以記錄到具有明顯時間及電壓依賴特性的對細胞外Cs+敏感的超極化激活的內(nèi)向電流，其在-140mV指令電壓下的平均電流密度為-42.8±3.6pA/pF；在指令電壓的末端去極化至+20mV時

11、可以記錄到明顯的尾電流；而EGFP對照組未能檢測到明顯的超極化內(nèi)向電流。
　　 3.經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)后實驗兔基礎(chǔ)心率顯著下降(307±21次/分 vs126±28次/分，p<0.01)。以不同頻率刺激右側(cè)迷走神經(jīng)均表現(xiàn)為心率減慢，刺激左側(cè)迷走神經(jīng)也以心率減慢為主，隨刺激頻率增加可出現(xiàn)竇性停搏及交界性逸搏心律。以10Hz以上刺激頻率同時刺激雙側(cè)迷走神經(jīng)可以出現(xiàn)竇性停搏及室性逸搏，部分出現(xiàn)3度房室傳導(dǎo)阻滯。隨著雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激頻率的

12、增加，達到刺激終點所需的刺激時間逐漸縮短。所有實驗兔在終止刺激后均能逐漸恢復(fù)刺激前竇性節(jié)律，但恢復(fù)時間隨刺激頻率增加而延長。
　　 4.經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)基礎(chǔ)上迷走神經(jīng)刺激抑制竇性節(jié)律條件下，移植后3天時各組實驗兔出現(xiàn)的室性逸搏心率無統(tǒng)計學(xué)差異；移植后1周mHCN4組僅有1只出現(xiàn)高于對照組及EGFP組心率的移植細胞來源的室性節(jié)律；移植后2周及4周時，mHCN4組室性心率顯著高于對照組及EGFP組，QRS波時間也顯著短于對照組及EG

13、FP組。
　　 5.隨著時間延長細胞移植區(qū)HE染色呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)演變：移植后3天時移植細胞多為圓形并成簇聚集，與周圍正常心室肌界限明顯；移植后1周時移植細胞數(shù)量明顯減少，與正常心室肌相鄰處可見少量細胞呈短梭形；移植后2周時移植細胞與周圍心室肌過渡較為自然，梭形細胞數(shù)量增多；移植后4周時存活移植細胞形態(tài)基本呈長梭形，與周圍心室肌界限較模糊。對照組注射等體積培養(yǎng)基后移植部位組織切片HE染色表現(xiàn)為輕微炎癥反應(yīng)，動態(tài)演變不明顯。DAB

14、顯色可見移植細胞與宿主細胞之間CX43、CX45均有表達，呈褐色，線、顆粒狀。
　　 6.移植細胞在移植術(shù)后3d時即可檢出EGFP和mHCN4陽性表達，但細胞基本呈圓形，尚未伸展開，CX43、CX45表達為陰性。移植后1周時存活細胞減少，少量細胞呈短梭形，EGFP、mHCN4及CX43、CX45表達均為陽性。移植后2周時移植細胞伸展為長梭形，形態(tài)接近于相鄰心室肌細胞，可見移植細胞與宿主細胞之間CX43、CX45陽性表達。移植后4

15、周時鏡下表現(xiàn)與移植后2周相似。
　　 結(jié)論：
　　 1.mHCN4基因可成功轉(zhuǎn)染至兔MSCs，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后可穩(wěn)定表達。
　　 2.mHCN4基因轉(zhuǎn)染修飾的兔MSCs可成功記錄到If電流，具備心臟起搏細胞的電生理特性。
　　 3.采用化學(xué)消融竇房結(jié)基礎(chǔ)上雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激法可以成功制備緩慢性心律失常模型，能夠滿足生物起搏在體實驗研究要求。
　　 4.mHCN4基因修飾的兔MSCs左室游離壁心外