miR-26a在子宮平滑肌瘤發(fā)病中的作用及其啟動子調控區(qū)CpG二核苷酸甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、研究背景與目的:子宮肌瘤是女性生殖器最常見的良性腫瘤，多見于30-50歲的婦女，發(fā)病率占20-30％，有報道40-50歲婦女子宮肌瘤發(fā)病率高達51.2％-60％。其主要癥狀包括異常子宮出血、盆腔受壓引起下腹部不適、肌瘤變性或扭轉引起疼痛等，嚴重時甚至可致流產或不孕等，嚴重威脅廣大女性的身心健康。子宮肌瘤雖為良性腫瘤，但也有少數可發(fā)生惡變(0.13％～1.39％)，加之其居高不下的發(fā)病率，年輕化的發(fā)病趨勢，對整個醫(yī)療體系及社會的長遠發(fā)展造

2、成了很大的影響。目前對于其發(fā)病機制尚不明確，若能對發(fā)病機理有新的認識可為其治療提供新的思路。
　　 目前普遍認為子宮肌瘤是雌、孕激素依賴性的良性腫瘤，藥物治療主要通過拮抗雌、孕激素及其受體的表達。在課題組前期實驗中，我們發(fā)現在子宮肌瘤中miR-26a顯著低表達的(P＜0.05)，對ERα、PRa起調控作用，所以我們猜測是否miR-26a在子宮肌瘤中對ERα、PRa的調節(jié)失控，促使ERα、PRa的表達增加，從而增加子宮平滑肌瘤細胞

3、對雌、孕激素的敏感性增加而促進肌瘤的生長？再者miR-26a在子宮肌瘤中低表達是否是因為其上游的啟動子調控區(qū)CpG位點發(fā)生甲基化而引起的？基于前期實驗結果、miR-26a研究現狀及立題思路，我們試圖通過研究miR-26a的表達對雌、孕激素生物學效應的影響，探討miR-26a在子宮平滑肌瘤發(fā)病中的作用，以及通過對miR-26a上游啟動子調控區(qū)CpG位點的甲基化分析進一步深入探討子宮平滑肌瘤的發(fā)病機制，以期能為子宮平滑肌瘤的的靶向治療提供新

4、的思路。
　　 研究方法:我們通過Ⅰ型膠原酶消化、篩網過濾分離法成功分離培養(yǎng)了子宮平滑肌瘤細胞，并對所獲得的細胞根據化學免疫進行純度鑒定。
　　 原代培養(yǎng)的細胞，通過脂質體轉染miR-26a的mimic及miR-26a的inhibitor分別使其高表達和低表達，或加入雌、孕激素受體拮抗劑，從而得基礎分組（Blank組、NC mimic組、miR-26amimic組、miR-26a inhibitor組、ERα拮抗劑組、P

5、Ra拮抗劑組），之后每組分別加入雌激素或孕激素，培養(yǎng)48h后進行CCK-8增殖檢測，檢測雌、孕激素與其受體抑制的增殖作用以及miR-26a高、低表達時加入雌、孕激素后的增殖作用，從而驗證miR-26a在子宮平滑肌瘤細胞中對雌、孕激素敏感性的影響，以從細胞水平上進一步探討miR-26a在子宮肌瘤中的作用。
　　 用軟件分析miR-26a上游的的啟動子452堿基序列，發(fā)現該序列中有潛在4個甲基化位點（30位點、99位點、283位點、

6、406位點），用BSP測序法（即結合重亞硫酸鹽測序法）檢測miR-26a基因啟動子4個CpG位點的甲基化頻率。首先通過收集子宮肌瘤組織及瘤旁的正常肌層組織6例，進行基因組DNA的提取，用重亞硫酸鹽處理基因組DNA，修飾后純化與回收，對修飾后的CpG進行PCR擴增，最后對PCR產物進行TA克隆，每個組織對應的DNA選取10個轉化子進行測序，并與參考序列進行對比，即可確定所研究的CpG位點的甲基化頻率，共12個組織，挑取120個克隆，測序1

7、20個反應，從而確定了4個位點的CpG甲基化頻率。
　　 實驗結果:通過Ⅰ型膠原酶消化法成功培養(yǎng)子宮平滑肌瘤細胞，其成功率達89％。并根據細胞的化學免疫方法檢測出所獲得的子宮平滑肌瘤細胞中肌動蛋白的表達進行鑒定，得到細胞的純度在96％以上。
　　 我們將帶羧基熒光素的NC mimic轉染細胞后，發(fā)現細胞的轉染效率在75％以上。實驗結果顯示，細胞轉染miR-26a mimic組增殖速度顯著慢于對照組(P＜0.05)，抑制細

8、胞增殖，且其抑制作用與單獨加入雌激素受體拮抗劑或孕激素受體拮抗劑相當，加入雌激素、孕激素后，miR-26a mimic組抑制增殖作用未明顯增強;而轉染miR-26ainhibitor組與對照組相比細胞增殖快(P＜0.05)，再加入雌、孕激素后其增殖作用較前明顯增強(P＜0.05)，說明低表達miR-26a可以增強子宮平滑肌瘤細胞對雌、孕激素的敏感性，從而促進細胞增殖。
　　 BSP克隆測序法檢測結果顯示，重亞硫酸鹽的轉化效率在9

9、8％以上，子宮平滑肌瘤與正常肌層樣本中總體甲基化狀態(tài)差異不明顯(甲基化頻率分別為63.67％±13.21，64.58％±10.54); miR-26a上游啟動子序列的四個CG位點（30位點、99位點、283位點、406位點）在子宮平滑肌瘤與正常肌層中的甲基化頻率分別為73.33％±23.38,58.33％±24.83;68.33％±14.72,56.67％±19.66;70％±8.94，70％±12.65;51.67％±7.53，73.

10、33％±16.33），其中406位點在子宮平滑肌瘤組織中的甲基化頻率明顯低于正常肌層組織(P＜0.05)。
　　 結論:本實驗通過膠原酶單次消化法高效獲得了原代培養(yǎng)的子宮平滑肌瘤細胞，可為子宮肌瘤體外實驗研究提供細胞模型;miR-26a低表達能增加子宮平滑肌瘤細胞對雌、孕激素的敏感性，而促進子宮肌瘤的發(fā)生，這可能是通過miR-26a調控ERα、PRa的表達來實現的，說明miR-26在子宮平滑肌瘤發(fā)病中起重要作用;子宮平滑肌瘤中m