有機磷農藥敵敵畏和亞胺硫磷免疫檢測方法的研究.pdf

1、有機磷農藥是目前我國使用最多的農藥，其中敵敵畏（dichlorvos，DDVP）和亞胺硫磷（phosmet，PMP）都是有機磷農藥中最常用的品種。
　　 由于DDVP和PMP使用廣泛，要保證所有食品完全不含其殘留是不可能的。世界上幾乎所有國家都制定了食品和飼料中DDVP和PMP的最大允許含量并作為強制性限量標準。目前，檢測DDVP和PMP的方法主要有氣相色譜法和酶抑制法，但是前者的樣品前處理過程復雜并需要昂貴的儀器設備，而后者的

2、假陽性較高。為此，免疫學方法因其具有快速、準確、靈敏、操作簡單、成本低等優(yōu)點而成為檢測DDVP和PMP等有機磷農藥的研究熱點。
　　 本課題從抗原的構建著手，首先采用Mannich法將DDVP、PMP與陽離子化牛血清白蛋白（cationized bovine serum albumin，cBSA）偶聯(lián)，構建了完全抗原DDVP-cBSA和PMP-cBSA，然后利用紫外和紅外光譜分析方法對它們進行了分析。在此基礎上，分別以DDVP-

3、cBSA和PMP-cBSA免疫BALB/c小鼠，分析了兩種抗體的產生進程、效價和靈敏度。同時以DDVP-cBSA為免疫抗原，采用細胞雜交瘤技術，獲得了能穩(wěn)定分泌抗DDVP單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對單克隆抗體的效價和靈敏度進行了分析。
　　 1．完全抗原的構建及其光譜學分析
　　 DDVP和PMP的分子量分別為190和317，是只有反應原性而無免疫原性的半抗原（hapten），只有通過與載體蛋白偶聯(lián)，才能刺激機體產生抗體

4、。
　　 本研究首先制備了cBSA，然后采用Mannich法，使其與DDVP和PMP偶聯(lián)，得到摩爾比分別為40：1和1.5：1的DDVP-cBSA與PMP-cBSA。
　　 再利用UV-Vis和FT-IR光譜分析方法，對cBSA、DDVP-cBSA和PMP-cBSA進行分析。結果表明，cBSA的UV-Vis最大吸收峰有微弱藍移，而DDVP-cBSA在278 nm處有蛋白質的吸收峰，其雜質峰掩蓋了DDVP的特征吸收峰；PM

5、P-cBSA在278 am處的吸收峰，迭加了PMP的特征吸收峰。在FT-IR．中，DDVP與cBSA偶聯(lián)后，在1286～1258 cm-1處和1050～950 cm-1出現了DDVP弱峰以及蛋白質1650 cm-1處的強峰；PMP與cBSA偶聯(lián)后，在833～790 cm-1處和663～645 cm-1處出現了PMP弱峰和蛋白質1650 cm-1處的強峰。
　　 上述光譜分析結果表明，DDVP和PMP與cBSA偶聯(lián)成功。
　

6、　 2．抗DDVP和PMP多克隆抗體的制備及其性質研究
　　 以DDVP-cBSA和PMP-cBSA分別免疫BALB/c小鼠，免疫間隔為15 d，免疫3～4次后，均能有效地產生抗體。其中，抗DDVP抗血清效價在免疫7次后最高達1.6×104，而抗PMP抗血清效價在免疫6次后最高達1.2×104。間接競爭ELISA分析表明，兩種抗血清的靈敏度分別達到473 ng/mL和482 ng/mL。
　　 3．抗DDVP單克隆抗體