裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum SR21）發(fā)酵制備二十二碳六烯酸（DHA）過程的初步研究.pdf

1、全順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,簡稱DHA)是一種具有重要生理意義和經(jīng)濟價值的多不飽和脂肪酸.它不僅是嬰幼兒大腦、視覺正常發(fā)育的必需物質(zhì),而且還具有延緩老年人大腦和視覺功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反應(yīng)、抑制腫瘤等功效.因此,DHA已廣泛用于生產(chǎn)嬰幼兒食品、保健食品和輔助治療劑等產(chǎn)品,其制備和加工方法也日受關(guān)注.目前DHA的主要制備方法是從深海魚油中提取.由

2、于魚油資源有限、成份復(fù)雜,這種制備方法存在供應(yīng)不穩(wěn)定、產(chǎn)量有限、成本較高等問題,限制了DHA的進一步應(yīng)用.更不利的是,由于海洋環(huán)境污染的惡化,這種方法的安全性受到了越來越多的質(zhì)疑.因此,開發(fā)安全、可靠的DHA新來源已成為當(dāng)前研究的熱點. 裂殖壺菌Schizochytrium limacinum SR21是一種海洋真菌,該菌DHA含量高、生長快、易于培養(yǎng)、對人畜無毒害,是一種極具生產(chǎn)前景的DHA微生物資源.本文系統(tǒng)研究了利用Sch

3、izochytrium limacinum SR21制備DHA的相關(guān)過程及工藝.論文首先對菌體中的DHA提取和檢測過程進行了研究、確定了較佳的DHlA提取路線和檢測方法;其后,在搖瓶中對.Schizochytrium limacinum SR21的液體發(fā)酵條件進行了考察和優(yōu)化,顯著提高了DHA的產(chǎn)量;最后,為了改進菌體生長最適溫度(25℃)低于常溫這一不利于工業(yè)化生產(chǎn)的缺點、同時也為了進一步提高DHA產(chǎn)量,根據(jù)設(shè)定的選育路線和篩選模型對

4、原始菌株進行了初步誘變育種并取得了一定進展. 首先對DHA的提取過程和檢測方法進行了研究.比較了六種破胞方法,確定了120℃、干燥3h的高溫干燥方法,該法在盡量破碎菌體細胞的同時避免DHA的破壞;改進了酸性氯仿甲醇法,采用鹽酸水解干菌體后用體積比為2 : 1的氯仿一甲醇溶液萃取脂質(zhì)的方法,實現(xiàn)了脂質(zhì)的充分、高效提取;優(yōu)化了甲酯化DHA的三氟化硼乙醚催化法,將對甲酯化效果有重要影響的0.8mol·L<'-1>的KOH-MeOH用量

5、優(yōu)化為0.0707ml·mg<'-1>脂質(zhì);最后確定了DHA的氣相色譜檢測參數(shù).其次,在搖瓶中對Schizochytrium limacinum SR21制備DHA的液體發(fā)酵條件進行了考察和優(yōu)化.首先,考察了碳源、氮源以及金屬離子等培養(yǎng)基組成對菌體生長和DHA產(chǎn)量的影響.發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酵母粉和蛋白胨濃度對單位菌體的DHA含量無顯著影響、但對細胞干重具有正效應(yīng);而K<'+>能促進菌體生長,但會降低單位菌體中的DHA含量.其后,采用單因素實驗

6、考察了種齡、接種量、裝液量、發(fā)酵液初始pH值和發(fā)酵溫度等操作條件的效應(yīng),初步確定了各操作條件的最適參數(shù),并發(fā)現(xiàn)變溫培養(yǎng)方式有利于提高DHA在脂質(zhì)中的含量.最后,采用均勻設(shè)計方法對等關(guān)鍵因素進行了進一步的優(yōu)化,通過對實驗結(jié)果回歸建模的方法確定最適培養(yǎng)基組成為:葡萄糖145g·L<'-1>,酵母粉2.6g·L<'-1>,蛋白胨5.2g·L<'-1>,K<'+>濃度10mM·L<'-1>,海水晶20g·L<'-1>,磷酸鹽緩沖體系,pH 6.

7、8;最適操作條件為:裝液量為250ml的三角燒瓶中裝20ml的發(fā)酵液,種齡24h,接種量4﹪,培養(yǎng)時間5天,前三天25℃培養(yǎng),后兩天20℃培養(yǎng).在此優(yōu)化條件下,細胞干重達到55.64g·L<'-1>,DHA產(chǎn)量達到12.61g·L<'-1>.與優(yōu)化前的DHA產(chǎn)量4.15g·L<'-1>相比,優(yōu)化使DHA產(chǎn)量提高了2.04倍. 最后,對SR21菌株進行了誘變育種以改變其最適溫度低于常溫這一不利于工業(yè)化生產(chǎn)的缺點、同時也試圖進一步提