二十二碳六烯酸抑制炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善肺血管重塑.pdf

1、目的:肺高壓(PH)是肺血管阻力持續(xù)升高，右心室負(fù)荷不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性右心衰竭甚至死亡的常見嚴(yán)重并發(fā)癥。近年來研究認(rèn)為肺血管炎癥及血管細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在PH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。二十二碳六烯酸(DHA)是n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)的主要成分，具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及抗炎等效應(yīng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)DHA能改善低氧性肺動(dòng)脈高壓。本研究擬采用野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺高壓模型，進(jìn)一步探討DHA的防治肺高壓作用及其機(jī)制。<

2、br>　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:SD(200-250g)大鼠40只，每組10只，隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（生理鹽水注射），MCT造模組（腹腔單次注射MCT，4周），MCT造模組+DHA灌胃預(yù)防組（腹腔注射MCT當(dāng)天即給予DHA灌胃，持續(xù)4周），MCT造模+DHA治療組（腹腔注射MCT兩周后給予DHA每天灌胃，持續(xù)2周）。
　　(1)右心導(dǎo)管法檢測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈平均壓;沿室間隔分離右心室(RV)，左室+室間隔(LV+S)分

3、別稱取質(zhì)量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù):RV/(LV+S);(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織細(xì)胞因子IL6，TNF-α，MCP-1及IL1β基因表達(dá);(3)免疫組化法檢測(cè)①肺動(dòng)脈中膜厚度②肺組織及阻力性肺動(dòng)脈周圍CD3+T細(xì)胞及CD68+巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù);(4)免疫印跡法檢測(cè)肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平;(5)免疫熒光雙染檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在肺組織中膜的表達(dá)差異。
　　2.組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)并進(jìn)行免疫熒光

4、細(xì)胞鑒定。
　　(1)免疫印跡及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PASMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)水平;(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PASMC的NFATc l-4基因表達(dá)水平;(3)免疫印跡檢測(cè)NFATc1的總蛋白水平及核轉(zhuǎn)移情況;(4) CCK8及BrdU攝入檢測(cè)PASMC增殖;(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PASMC細(xì)胞周期;(6)免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組大鼠相比，MCT組大鼠4周后平均肺動(dòng)脈壓顯著升高(M

5、CT:48.2+3.1mmHg vs control:20.5±1.3mmHg;p＜0.05);DHA預(yù)防及治療可顯著降低MCT誘導(dǎo)的PH大鼠平均肺動(dòng)脈壓（MCT+DHA預(yù)防組:25.3+2.1mmHg; MCT+DHA治療組:31.5+3.4mmHg; p＜0.05vs MCT組）及右心指數(shù)（MCT+DHA預(yù)防組:0.37±0.02; MCT+DHA治療組:0.42±0.01; p＜0.05 vs MCT組）;并顯著抑制MCT誘導(dǎo)的大

6、鼠肺動(dòng)脈中膜增厚。
　　2.DHA預(yù)防及治療可顯著減少M(fèi)CT誘導(dǎo)的大鼠肺組織IL1β，TNFα，IL-6和MCP-1基因表達(dá)(p值均＜0.05);并抑制MCT誘導(dǎo)的大鼠肺組織及肺血管周圍CD3+T細(xì)胞及CD68+巨噬細(xì)胞的聚集。
　　3.DHA預(yù)防及治療可顯著減少M(fèi)CT誘導(dǎo)的大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表達(dá)（p值均＜0.05）;免疫熒光雙染表明DHA主要減少肺動(dòng)脈平滑肌層PDI的表達(dá)。

7、r>　　4.在培養(yǎng)的PASMC，PDGF-BB刺激能顯著增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表達(dá)（p值均＜0.05）而DHA預(yù)孵能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá);免疫熒光表明PDGF-BB刺激PASMC后PDI熒光信號(hào)增強(qiáng)，而預(yù)孵DHA能減弱熒光信號(hào)。
　　5.PDGF-BB刺激能誘導(dǎo)PASMC的NFATc1，NFATc2及NFATc3基因表達(dá)增加(p＜0.05 vs對(duì)照組)而對(duì)NFATc4

8、無顯著影響;預(yù)孵DHA能逆轉(zhuǎn)PDGF-BB誘導(dǎo)的NFATc1及NFATc2的基因表達(dá)，而對(duì)NFATc3無顯著影響。
　　6.PDGF-BB刺激能誘導(dǎo)PASMC的NFATc1總蛋白表達(dá)增加，蛋白核轉(zhuǎn)移增多，而預(yù)孵DHA及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA能產(chǎn)生類似的抑制PDGF-BB誘導(dǎo)性NFATc1總蛋白表達(dá)增加及活性增強(qiáng)。
　　7.PDGF-BB刺激PASMC能顯著促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)，抑制G1期相關(guān)負(fù)性蛋白p2

9、1和p27表達(dá)，處于細(xì)胞周期S期百分比增多，細(xì)胞增殖增加;而DHA預(yù)孵或NFATc1 siRNA干擾能產(chǎn)生類似的抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的cyclin D1表達(dá)增加，恢復(fù)p21和p27的蛋白水平，將細(xì)胞阻滯于G1期，抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMC的增殖。
　　結(jié)論:
　　1.DHA抑制MCT誘導(dǎo)的PH的肺組織及肺血管周圍炎癥反應(yīng)。
　　2.DHA抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少PASMC增殖，改善肺