重組人胰高糖素樣肽-1突變體的串聯(lián)體與人血清白蛋白融合蛋白的純化及純度鑒定.pdf

1、本文利用構(gòu)建好的重組PichiaPastorisKM71/(GLP-1A2G)2-HSA酵母工程菌株表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行了較深入的純化工藝研究和簡(jiǎn)單的體內(nèi)、體外活性研究。 將生產(chǎn)菌株增菌培養(yǎng)至一定菌體量后，用BMMY培養(yǎng)基懸浮菌體后定時(shí)添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。研究表明重組PichiaPastorisKM71/(GLP-1A2G)2-HSA的最佳誘導(dǎo)條件為溫度30℃、pH6.0、甲醇濃度2.0％、誘導(dǎo)時(shí)間為6

2、0h。此最優(yōu)化條件既節(jié)省反應(yīng)材料，又可以提高效率，目標(biāo)蛋白的最高產(chǎn)量可達(dá)到210mg/L。 發(fā)酵液經(jīng)過(guò)4℃，10000rpm，15min離心除菌離心后，采用截留分子量為10KDa的Biomax超濾膜對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)可達(dá)到20倍，回收率最高可達(dá)到90％。在精細(xì)分離過(guò)程中，首先將濃縮后的發(fā)酵液上Q-SeperoseFastFlow陰離子交換層析，上樣后進(jìn)行階段洗脫，目標(biāo)蛋白在鹽濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)開始被洗脫下來(lái)，回

3、收率達(dá)74％。所得到的洗脫成分處理后上HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示純度為90％，SDS-PAGE顯示為一條帶。將Q-Seperose陰離子交換層析后的洗脫液濃縮后上SephacrylS-200凝膠過(guò)濾，結(jié)果出現(xiàn)兩個(gè)蛋白吸收峰，經(jīng)檢測(cè)后一個(gè)峰為目標(biāo)蛋白分子吸收峰。將蛋白活性峰上HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示純度達(dá)98％以上，經(jīng)I125標(biāo)記后，采用TCA沉淀法測(cè)定放射化學(xué)純度達(dá)97％，純度優(yōu)于藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求，達(dá)到了預(yù)期純化目標(biāo)。本純化工藝由發(fā)酵上清