基于乳源蛋白分析的乳品質量檢測控制技術研究.pdf

1、乳品質量安全備受關注，使針對各種花樣繁多的摻假檢驗方法成為乳品質量安全控制的關鍵。本課題運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法分析牛乳固有蛋白成分及其含量，獲得了乳源蛋白電泳分析圖譜，并建立了分別以牛β-酪蛋白（β-CN）和β-乳球蛋白（β-Lg）為目標蛋白的競爭ELISA和間接ELISA檢測體系，實現了對牛乳固有蛋白的多指標定性定量分析。
　　 檢測牛乳蛋白的SDS-PAGE

2、電泳技術研究。選用原料牛乳和脫脂牛乳進行電泳，采用脫脂牛乳進樣，分離膠濃度為17％、濃縮膠濃度為3％的不連續(xù)垂直穩(wěn)流電泳，實驗可以得到比較好的乳蛋白分離分析圖譜。用大豆蛋白粉和牛乳清粉配制系列摻假樣品進行SDS-PAGE電泳，所得圖譜結合凝膠圖像分析系統(tǒng)可知：SDS-PAGE可以檢測出牛乳中摻入的非乳源蛋白（大豆蛋白粉）和乳源蛋白（牛乳清粉），其檢出限分別為0.79％和4.4％。再用市售嬰幼兒乳粉對所建立的電泳檢測方法進行驗證，實驗證明

3、電泳技術是一種直觀、有效的乳蛋白檢測方法，能夠應用于乳及乳品質量監(jiān)控。
　　 乳源蛋白質的特異性雞卵黃抗體制備。選擇牛β-酪蛋白和β-乳球蛋白2種免疫原分別免疫臨產蛋雞，收集免疫后的高免雞蛋，采用水稀釋法，經過膜過濾、鹽析、DEAE FF離子交換、親和色譜等步驟，得到純化IgY樣品（anti-β-CN IgY、anti-β-Lg IgY），其純度高達90％，每個卵黃中可獲得100 mg～130 mg的特異性IgY，ELISA效價

4、（稀釋起始濃度均為1mg/ml）在1：2048～1：4096。anti-β-Lg IgY抗體與其相應抗原反應特異性良好，但anti-β-CN IgY與β-Lg和大豆蛋白粉交叉反應明顯，采用抗體修飾技術增強其特異性，得到blocked anti-β-CNIgY可用于ELISA檢測。
　　 兩種乳源蛋白質抗原的酶標記技術研究。為建立競爭ELISA檢測體系，選用HRP（辣根過氧化物酶）通過過碘酸鈉氧化法分別標記β-酪蛋白和β-乳球蛋白

5、抗原，結果顯示：過碘酸鈉氧化法標記上述兩種抗原的酶結合率、標記率、克分子比值合適。當β-CN-HRP反應體系中HRP與IgY的分子個數比為1：1時，標記效果最好（克分子比值0.11，結合率23.9％，標記率85.4％），而在β-Lg-HRP反應體系中，HRP與IgY的分子個數比為1.5：1時，標記效果最好（克分子比值0.05，結合率23.9％，標記率60.9％），所制得的酶標抗原的效價最高均可達1：640（酶標抗原起始濃度1mg/ml）

6、。
　　 建立了以β-酪蛋白為目標蛋白的競爭ELISA檢測方法。確定了包被抗體最佳濃度（antl-β-CN IgY1：60）、封閉液及封閉時間（1％明膠的PBST，封閉1h）、酶標抗原（1：20）和待測牛乳樣品（1：80）稀釋液與抗體作用時間（60min）、底物最佳反應時間（20min，37℃）等對競爭ELISA效果有重要影響的因素，完成了檢測抗原β-酪蛋白競爭ELISA法的優(yōu)化，實驗可在2小時內完成。
　　 實驗證明β