新型抗凝、防栓劑——重組雙功能水蛭素（r-RGD-Hirudin）的研制.pdf

1、天然水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑，從醫(yī)用水蛭的唾液腺中提取而得。為65-66個(gè)氨基酸殘基的無(wú)糖基化的單鏈多肽，分子量約7,000Da，N端為活性中心區(qū)，能插入凝血酶的活性中心，抑制凝血酶活性；N端區(qū)域所含3對(duì)二硫鍵對(duì)空間構(gòu)象起穩(wěn)定作用；C端含有較多的酸性氨基酸，能與凝血酶分子堿性氨基酸富集的區(qū)域特異性結(jié)合，與其強(qiáng)烈的抗凝活性也有重要關(guān)系。水蛭素對(duì)凝血酶有很高的親和力，它與凝血酶形成摩爾比為1：1的非共價(jià)結(jié)合的可逆復(fù)合物，使凝血酶失去裂解

2、纖維蛋白原的能力，抑制纖維蛋白的凝固，同時(shí)它也能阻斷凝血酶催化的止血反應(yīng)及凝血酶誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)，所以極低濃度的水蛭素即可抑制凝血酶，顯示抑制血液凝固等功效。基于水蛭素的這些特點(diǎn)，用它作為防治血栓的藥物有諸多優(yōu)點(diǎn)，(1)專一性強(qiáng)，直接特異性抑制凝血酶活性，不良反應(yīng)少而輕；(2)分子量小，幾乎沒(méi)有抗原性；(3)小分子蛋白質(zhì)，幾乎沒(méi)有毒性。 基于對(duì)天然水蛭素構(gòu)效關(guān)系的深入研究，在保留天然水蛭素原有活性的基礎(chǔ)上，將Arg-Gly-As

3、p(RGD)融合在水蛭素分子的合理部位，由此形成新型分子，然后構(gòu)建了含RGD編碼順序的水蛭素衍生物cDNA克隆RGD-Hirudin-pPIC9K，表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，經(jīng)篩選獲得快型高表達(dá)菌株，并建立工程菌株。發(fā)酵罐大量培養(yǎng)工程菌，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，從培養(yǎng)液上清純化表達(dá)產(chǎn)物，并證明表達(dá)產(chǎn)物兼有抗凝血酶和抗血小板聚集的雙重功能，我們將其命名為重組雙功能水蛭素(r-RGD-Himdin)。 藥效學(xué)研究證明，r-RGD-Himdin用

4、于血管吻合術(shù)后抗凝、防栓治療，療效確切。治療劑量比野生型水蛭素降低2-3倍，未見(jiàn)出血等不良反應(yīng)，預(yù)計(jì)臨床試用也會(huì)安全、有效。 利用超臨界C02包衣技術(shù)，將聚乳酸等包衣材料均勻包覆在藥物顆粒表面，形成卜RGD-Hirudin的口服制劑，能抵抗胃酸和消化酶對(duì)藥物的降解作用，口服后6-8小時(shí)，藥物通過(guò)結(jié)腸吸收。這種技術(shù)可用于其他蛋白質(zhì)／多肽類藥物的特殊制劑的研究。 一、基于蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究，設(shè)計(jì)和研制r-RGD-Himdin

5、 經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分子模擬，設(shè)計(jì)了新型RGD-Himdin分子。根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子對(duì)天然水蛭素基因的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，并在合理位置融合了Arg-Gly-Asp（RGD)三肽編碼序列，合成目的基因。將全合成的目的基因與畢赤酵母載體pPIC9K質(zhì)粒重組構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115宿主菌，經(jīng)G418篩選得到高表達(dá)的陽(yáng)性克隆，PCR鑒定為甲醇利用快型(Mut+)。在搖瓶實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定和分泌性表達(dá)r-RGD-Himdin；表達(dá)量達(dá)0．

6、1g幾。 分離、純化表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)核磁共振試驗(yàn)，結(jié)果顯示與天然水蛭素相比，構(gòu)成r-RGD-Himdin分子空間構(gòu)象最重要的4個(gè)氨基酸，即Tyr3，His51，Phe56和Tyr64的芳環(huán)上的質(zhì)子的化學(xué)位移幾乎沒(méi)有什么變化，說(shuō)明r-RGD-Himdin的空間結(jié)構(gòu)沒(méi)有因?yàn)镽GD三肽序列的引入而產(chǎn)生明顯的變化。凝血酶滴定法測(cè)定r-RGD-Himdin的抗凝血酶比活性大于10,000ATU／mg，和wt-Himdin幾乎沒(méi)有差別；比濁法測(cè)

7、定r-RGD-Himdin抗血小板聚集比活性，終濃度1.5μg／mL，血小板聚集抑制率為10-20％，說(shuō)明r-RGD-Himdin具有抗血小板聚集的功能。 放射競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)顯示r-RGD-Himdin競(jìng)爭(zhēng)性抑制纖維蛋白原與血小板結(jié)合，半數(shù)抑制濃度為0．4gmol／L；r-RGD-Himdin與血小板結(jié)合的親和力比纖維蛋白原大37倍。利用流式細(xì)胞技術(shù)研究了r-RGD-Himdin與血小板膜GPIIb／IIIa的親和力，與臨床常用的

8、抗GPIIb／IIIa藥物一一硫酸氫氯吡格雷相比，r-RGD-Himdin對(duì)GPIIb／IIIa的半數(shù)抑制濃度為0．3gmol／L；以完全抑制血小板活性的藥物終濃度相比，卜RGD-Himdin與血小板結(jié)合能力比硫酸氫氯吡格雷大500倍。。 二、卜RGD-Himdin的中試研究 在實(shí)驗(yàn)室初步表達(dá)試驗(yàn)及優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用30LNBS發(fā)酵罐(BioFlo4500)研究溶氧、接種密度、碳源、誘導(dǎo)時(shí)密度、誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇的具體控

9、制等發(fā)酵工藝的最適參數(shù)。 工程酵母菌(RGD-Himdin-GS115)經(jīng)3天發(fā)酵，離心后取培養(yǎng)液上清，超濾濃縮，凝膠過(guò)濾層析，離子交換層析后，得到比活性為12,000ATU／mg的r-RGD-Himdin，回收率大于50％，產(chǎn)率大于1．0g/L純化后的r-RGD-Himdin經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、LC／MS、等電聚焦電泳、Western-Blot和紫外吸收光譜等分析，其純度達(dá)到97％以上，分子量為7,030Da、等電點(diǎn)為pH4

10、．2左右，與野生型水蛭素相符，證明表達(dá)產(chǎn)物為水蛭素的衍生物，抗凝血酶活性測(cè)定和抗血小板聚集活性分析證明r-RGD-Himdin具有抑制凝血酶活性和抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集雙重功能。HPLC分析r．RGD-Hiredin純品含2個(gè)主峰，進(jìn)一步分析證明第一主峰是分子量為7,030Da，含量大于70％，含65個(gè)氨基酸殘基的r-RGD-Himdin，第二主峰是分子量為7,180Da，含量小于30％，含66個(gè)氨基酸殘基的卜RGD-Himdin，

11、兩者含量總和大于97％。分別測(cè)定兩者的抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性，幾乎沒(méi)有差別，說(shuō)明兩者都是r-RGD-Himdin。 純化后樣品含有磷酸鹽、氯化鈉、r-RGD-Himdin三種溶質(zhì)，三種溶質(zhì)的總含量為2-3％，以甘露醇為輔劑，制成靜脈注射用粉針劑，凍干品色澤均勻，穩(wěn)定性試驗(yàn)表明儲(chǔ)存于4-8℃2年以上，活性無(wú)明顯改變。 對(duì)中試產(chǎn)品的質(zhì)量控制作研究，原液的質(zhì)量控制和成品的質(zhì)量控制，共24項(xiàng)指標(biāo)均符合靜脈注射用藥的國(guó)

12、家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 三、r-RGD-Himdin的藥效學(xué)研究和安全性評(píng)價(jià) 建立了大鼠股動(dòng)脈吻合術(shù)后抗凝、防栓治療模型和兔頸總動(dòng)脈吻合術(shù)后抗凝防栓治療模型。大鼠腹腔注射卜RGD-HimdinO．1mg／kg、0．2mg／kg、0．5mg／kg。每日用藥1次，連續(xù)3天，首次靜脈注射，其后腹腔注射；家兔首次靜脈注射r-RGD-Hirodin，以后皮下注射，劑量為0．2mg／kg、0．5mg／kg、1．Omg／kg，每日用藥2次，連續(xù)

13、3天。試驗(yàn)結(jié)果證明r-RGD-Himdin用于血管吻合術(shù)后抗凝治療，療效優(yōu)于野生型水蛭素和肝素，降低血黏度，抗凝、防栓作用更強(qiáng)。臨床應(yīng)用劑量可望比野生型水蛭素降低2-3倍，有顯著療效，未見(jiàn)出血等不良反應(yīng)。 免疫原性試驗(yàn)顯示豚鼠腹腔注射r-RGD-Himdin3倍臨床擬單次使用劑量，隔天注射，共3次，2周和3周后靜脈注射6倍臨床擬單次使用劑量的r-RGD-Hirudin，未見(jiàn)過(guò)敏性休克；致敏2周和3周，取血，ELISA測(cè)定抗卜RG