應(yīng)激與“上火”——廣東涼茶作用機(jī)理與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文闡述了“上火”是機(jī)體對(duì)應(yīng)激負(fù)荷在心理和生理過程中產(chǎn)生的一種不協(xié)調(diào)的應(yīng)激反應(yīng)，是一種超越生理調(diào)節(jié)范圍內(nèi)身心疲勞的表現(xiàn)。從“上火”到形成疾病是一種涉及中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)過程。本文主要研究?jī)?nèi)容為以應(yīng)激負(fù)荷模擬大鼠和小鼠的“上火”狀態(tài)，從動(dòng)物整體水平及分子生物學(xué)水平研究“上火”的科學(xué)內(nèi)涵；并通過研究嶺南瀉火名方廣東涼茶的抗應(yīng)激藥理活性及其作用機(jī)制，力圖闡明廣東涼茶“清熱瀉火”作用機(jī)理；同時(shí)，建立廣東涼茶的HPLC指紋圖譜

2、，并采用開放柱層析，中低壓液相色譜(MPLC)以及高效液相色譜(HPLC)等適當(dāng)?shù)姆蛛x手段獲得活性單體，確定相應(yīng)的作用物質(zhì)基礎(chǔ)，提高廣東涼茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 首先，本研究以應(yīng)激負(fù)荷模擬了大鼠和小鼠“上火”狀態(tài)，論證了“上火”與應(yīng)激導(dǎo)致的機(jī)體中樞神經(jīng)遞質(zhì)變化、免疫功能下降、器官功能衰竭及糖脂代謝紊亂相關(guān)。并在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究廣東涼茶抗應(yīng)激藥理活性，實(shí)驗(yàn)從廣東涼茶對(duì)自發(fā)轉(zhuǎn)籠運(yùn)動(dòng)應(yīng)激負(fù)荷大鼠行為及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響，對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷誘發(fā)小鼠

3、免疫機(jī)能低下的影響，對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下肝損傷及應(yīng)激性炎癥的影響，對(duì)應(yīng)激性糖代謝紊亂的改善作用，以及對(duì)應(yīng)激性脂代謝紊亂的改善作用等幾個(gè)方面，評(píng)價(jià)了廣東涼茶通過改善機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)與防治疾病之間的關(guān)系，旨在闡明廣東涼茶藥理活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣東涼茶對(duì)轉(zhuǎn)籠應(yīng)激負(fù)荷大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和5-HIAA水平下降有一定的改善作用，能顯著降低轉(zhuǎn)籠應(yīng)激負(fù)荷大鼠大腦皮質(zhì)丙二醛(MDA)水平，并顯著提高大腦皮質(zhì)的抗氧化能力指數(shù)(ORAC)。廣東涼茶能減輕拘束應(yīng)激

4、負(fù)荷引起的免疫器官指數(shù)下降、緩解脾臟細(xì)胞總數(shù)減少、改善T淋巴細(xì)胞亞群比例紊亂、增加NK細(xì)胞及CTL殺傷活性等免疫學(xué)指標(biāo)。淋巴細(xì)胞內(nèi)氧化狀態(tài)初步研究結(jié)果提示廣東涼茶對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷引起的免疫功能低下的改善作用可能與廣東涼茶提高拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠脾細(xì)胞的抗氧化能力，并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)的含量有關(guān)。廣東涼茶對(duì)拘束負(fù)荷誘發(fā)小鼠氧化應(yīng)激性炎癥及肝損傷有明顯的改善作用，其改善作用可能是通過清除體內(nèi)自由基和防止脂質(zhì)過氧化實(shí)現(xiàn)的。此外，我們也發(fā)現(xiàn)

5、廣東涼茶能提高拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠口服葡萄糖的血糖消除速率，并降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿酮體水平和促進(jìn)其肝糖原的合成能力，加速糖能源的利用，提高機(jī)體的耐糖能力，調(diào)節(jié)應(yīng)激性糖代謝紊亂。廣東涼茶能提高拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠的血漿甘油三酯(TG)消除速率，同時(shí)提高腸系膜脂肪酶(LPL)的活性，加速脂肪能源的利用，增加動(dòng)物的脂肪耐受能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，廣東涼茶“瀉火”的作用機(jī)理與廣東涼茶對(duì)機(jī)體應(yīng)激負(fù)荷狀態(tài)的改善作用有關(guān)。 在廣東涼茶能有效改善機(jī)體應(yīng)

6、激負(fù)荷狀態(tài)的藥理活性研究基礎(chǔ)上，以廣東涼茶能改善拘束負(fù)荷誘發(fā)小鼠免疫機(jī)能低下這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為例，本研究進(jìn)一步探討廣東涼茶改善機(jī)體應(yīng)激負(fù)荷狀態(tài)的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)首先通過檢測(cè)拘束負(fù)荷小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)的MDA和ORAC水平，確定細(xì)胞內(nèi)氧化及抗氧化狀態(tài)。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)熒光染料特異性標(biāo)記檢測(cè)拘束負(fù)荷小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)的含氮類自由基(RNS)及活性氧(ROS)的水平。同時(shí)，測(cè)定小鼠脾細(xì)胞內(nèi)自由基清除系統(tǒng)的關(guān)鍵酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽

7、轉(zhuǎn)移酶(GPX)的活性。此外，我們還從基因水平檢測(cè)自由基產(chǎn)生的關(guān)鍵酶一氧化氮合酶(iNOS)和自由基消除的關(guān)鍵酶SOD的mRNA表達(dá)水平的變化。本研究通過對(duì)上述細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生和消除通路中各指標(biāo)的測(cè)定，探討應(yīng)激負(fù)荷造成機(jī)體損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制，進(jìn)而揭示廣東涼茶能改善應(yīng)激負(fù)荷狀態(tài)的科學(xué)內(nèi)涵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拘束負(fù)荷小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS和RNS含量顯著增加，表明拘束負(fù)荷對(duì)機(jī)體造成的應(yīng)激損傷可能和體內(nèi)毒害自由基的過渡產(chǎn)生有關(guān)。RT-PCR對(duì)

8、一iNOSmRNA表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，拘束負(fù)荷能明顯提高細(xì)胞內(nèi)iNOSmRNA的表達(dá)水平，表明應(yīng)激負(fù)荷小鼠體內(nèi)含氮類毒性自由基的大量產(chǎn)生可能是應(yīng)激負(fù)荷激活體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。拘束負(fù)荷組小鼠細(xì)胞內(nèi)自由基消除鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中關(guān)鍵酶SOD和GPX的活性及相關(guān)基因的表達(dá)異常，同時(shí)小分子抗氧化物質(zhì)GSH含量減少，結(jié)果表明應(yīng)激負(fù)荷時(shí)自由基消除鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的關(guān)鍵酶活性紊亂及重要小分子抗氧化物質(zhì)的耗竭進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷可能也是機(jī)體應(yīng)激損傷的機(jī)制

9、之一。廣東涼茶通過調(diào)節(jié)拘束負(fù)荷小鼠體內(nèi)RNS及ROS的產(chǎn)生，減少毒害作用較強(qiáng)的自由基·ONOO-及·OH的過度產(chǎn)生，同時(shí)調(diào)節(jié)清除自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中關(guān)鍵酶SOD和GPX的活性及相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)小分子抗氧化物質(zhì)GSH的耗竭。因此，廣東涼茶有調(diào)節(jié)應(yīng)激負(fù)荷狀態(tài)下機(jī)體氧化平衡的作用，通過緩解氧化應(yīng)激水平繼而改善機(jī)體的應(yīng)激狀態(tài)。 在以上廣東涼茶“瀉火”作用機(jī)理和機(jī)制的研究基礎(chǔ)上，本研究通過不同色譜條件摸索建立了廣東涼茶的HPLC指紋圖譜

10、，以確定廣東涼茶作用物質(zhì)基礎(chǔ)。并利用多種現(xiàn)代色譜分離手段(包括大孔樹脂DiaionHP-20，ODS，SephadexLH-20柱色譜，HPLC等)，富集并分離得到了HPLC指紋圖譜中的8個(gè)主要色譜峰，占總峰面積的93.63％。通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(MS、NMR)，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)為Gallicacid，Protocatechuicacid，(+)-Catechin，4-Hydroxybenzoicacid

11、，Caffeicacid，Ellagicacid-4-O-xylopyranoside，Isoquercitrin，Ellagicacid。通過體外活性測(cè)試，測(cè)定了所分離得到的8個(gè)主要色譜峰化合物對(duì)自由基的清除能力(用抗氧化能力指數(shù)ORAC值表示)以及對(duì)應(yīng)激負(fù)荷小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的調(diào)節(jié)作用(測(cè)定對(duì)ROS的抑制率)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物為活性成分，且活性與對(duì)照用藥物維生素C相當(dāng)或者更強(qiáng)。十批次涼茶產(chǎn)品HPLC分析研究

12、結(jié)果顯示廣東涼茶HPLC指紋圖譜的色譜行為穩(wěn)定，不同批次產(chǎn)品間色譜圖的相似度達(dá)到0.987以上，已經(jīng)初步建立了一套與活性相關(guān)的多組分/指紋圖譜控制產(chǎn)品質(zhì)量的方法。 綜上所述，“上火”是一種應(yīng)激性反應(yīng)，是機(jī)體受到應(yīng)激原刺激引起的一種為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的適應(yīng)能力的超負(fù)荷狀態(tài)。應(yīng)激負(fù)荷能導(dǎo)致機(jī)體過氧化損傷，破環(huán)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物的行為、神經(jīng)、免疫、糖脂代謝等功能的改變，這可能是“上火”發(fā)生的主要原因。廣東涼茶則通過調(diào)節(jié)應(yīng)激負(fù)荷