丙酮酸高分泌型菌種的選育及其相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用研究.pdf

1、本文著重研究了以細菌-運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)為出發(fā)菌種,利用物理和化學(xué)誘變劑對其進行逐步多次多因子復(fù)合誘變,通過碳酸鈣-紅四氮唑(TTC)篩選平板,篩選獲得了一株高產(chǎn)運動發(fā)酵單胞菌突變株--Z.m-4,該株產(chǎn)丙酮酸為2.75g/l、發(fā)酵時間為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的一半左右,大大提高了丙酮酸的產(chǎn)生效率。獲得的主要結(jié)論如下:1.通過測定運動發(fā)酵單胞菌在含有不同葡萄糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長時的OD600值(

2、600nm下的吸光度值),建立了其在不同糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線,確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳的葡萄糖含量為50g/L,發(fā)酵時間為33h。2.產(chǎn)丙酮酸菌株的生長環(huán)境為酸性,因此對運動發(fā)酵單胞菌進行耐酸性實驗。通過設(shè)置種子培養(yǎng)基的pH值梯度:6.5、6.0、5.5、5.0、4.5及4.0。將運動發(fā)酵單胞菌按照pH由高到低接種到種子培養(yǎng)基上,通過傳代培養(yǎng),使運動發(fā)酵單胞菌逐步適應(yīng)酸性環(huán)境,獲得耐酸性突變株Z.m-1。為最后丙酮酸高分泌菌種的

3、獲得打下良好的基礎(chǔ)。3.利用產(chǎn)丙酮酸的菌落可以和碳酸鈣平板反應(yīng)形成透明圈以及TTC可以與ADH酶作用而顯色的原理,確定了以碳酸鈣-TTC復(fù)合平板為主要篩選平板的突變菌株篩選方式。4.采用對Z.m-1進行硫酸二乙酯(DES)和紫外線多因子誘變處理,獲得了高產(chǎn)丙酮酸突變株。通過設(shè)置紫外線照射劑量梯度,計算因照射而造成的致死率,確定了紫外線的最適照射劑量為400S。DES的工作濃度為2％(v/v)和處理時間為30min。從出發(fā)菌株為不產(chǎn)丙酮酸

4、的Z.m-1中,通過誘變篩選獲得了一株產(chǎn)丙酮酸量為0.92g/L且遺傳穩(wěn)定性良好的突變株--Z.m-2。5.通過對單一菌種進行多次誘變,可以適當(dāng)降低誘變劑的劑量的原則,確定紫外線照射時間為320S,較最佳紫外照射時間減少了80S,甲基磺酸乙酯(EMS)工作濃度為0.1mol/L和處理時間為30min。通過對Z.m-2進行紫外線和EMS多因子誘變及熱處理后,篩選獲得了一株產(chǎn)酸量為2.67g/L的突變株--Z.m-3。6.利用紫外線和亞硝基

5、胍(NTG)多因子誘變以及熱處理對.Z.m-3進行誘變。紫外線的照射時間繼續(xù)降低80S,確定為240S。NTG工作濃度為0.1mg/ml,處理時間為30min。獲得了一株產(chǎn)酸量為2.75g/L的突變株--Z.m-4。7.通過對Z.m-4菌株的ADH酶和PDC酶酶活性的測定,可以得到,相對于誘變前的出發(fā)菌株,Z.m-4菌株的ADH酶活性降低了106Umol/min.g,PDC酶活性降低了274Umol/min.g。8.通過測定發(fā)酵液中的還

6、原糖含量,得到葡萄糖-丙酮酸的轉(zhuǎn)化率6.60％,由此印證了Z.m-4突變株中ADH和PDC酶活性并沒有被完全抑制,即丙酮酸-乙醇的代謝途徑?jīng)]有完全被切斷。9.由于出發(fā)菌株是細菌,細菌的發(fā)酵周期通常要比酵母縮短近一半,傳統(tǒng)的光滑球擬酵母發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸發(fā)酵周期為60h左右,而本實驗獲得的突變株發(fā)酵周期為33h,提高了工作效率。此研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸工業(yè)化的進程提供了一條新的思路。
　　 運動型飲料分別進行加熱滅菌和微孔膜過

7、濾法兩種方法滅菌處理,檢測處理過的飲料在儲存過程中微生物總量變化及大腸桿菌數(shù)量的變化,從而為這種飲料投入大規(guī)模規(guī)范性生產(chǎn)操作提供依據(jù)。方法:分別以營養(yǎng)瓊脂、Aliz-gal瓊脂MUGal肉湯作為培養(yǎng)基,采取平皿培養(yǎng)法對經(jīng)過加熱滅菌法和微孔膜過濾法的飲料進行微生物總量和大腸桿菌的檢測。結(jié)果:四個溫度的高溫滅菌及微孔膜過濾后所得的飲料樣品在30天內(nèi)總菌落數(shù)均小于10個/ml,大腸桿菌MPN均小于3/100ml。結(jié)論:70℃高溫滅菌及0.45

8、um微孔膜膜過濾處理后的飲料即可獲得長期穩(wěn)定的無菌飲料。
　　 輔課題中進行了雞糞和酒糟混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究。以雞糞和酒糟為原料,在單因次考察基礎(chǔ)上,利用正交試驗對混合發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳預(yù)處理條件為50ml/kg濃硫酸處理雞糞300s；最佳發(fā)酵生產(chǎn)條件:雞糞和酒糟比為3:7,尿素添加量3％,硫酸銨3％,玉米粉15％,金寶貝助酵劑0.4％,含水量60％,pH7.0,30℃,5d。最佳條件下粗蛋白