深海適冷蛋白酶MCP-01對(duì)膠原蛋白的催化機(jī)制及其在肉類嫩化中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、深海有機(jī)氮的降解是海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。在海洋中，生物合成的高分子量有機(jī)氮(High-Molecular-Weight Organic Nitrogen，HMWON)以顆粒有機(jī)氮(particulate organic nitrogen，PON)的形式，從海水表層，沉降到深海沉積物中。PON在微生物的作用下降解為高分子量的溶解有機(jī)氮(dissolved organicnitrogen，DON)，DON再經(jīng)過微生物的分解、氨化、硝

2、化和反硝化作用，最終完成整個(gè)氮循環(huán)。因此，深海沉積物中PON的降解在沉積物整個(gè)氮循環(huán)過程中具有非常關(guān)鍵的作用。深海沉積物中PON的主要成分是難以被降解的氨基化合物，如膠原蛋白和彈性蛋白等。膠原蛋白由于其特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的聚合形式，其穩(wěn)定性非常高，很難被除膠原蛋白酶以外的其他蛋白酶降解。目前，研究最多的膠原蛋白酶為哺乳動(dòng)物的基質(zhì)金屬蛋白酶。細(xì)菌中膠原蛋白酶的報(bào)道則較少，且多來自陸地致病菌。由于對(duì)海洋膠原蛋白酶缺乏研究，因此海洋中膠原

3、蛋白是如何被降解的還不清楚。研究深海膠原蛋白酶的作用機(jī)制對(duì)于最終闡明深海沉積物中氮的循環(huán)機(jī)制和開發(fā)新型蛋白酶具有重要的意義。
　　 適冷蛋白酶MCP-01是分離自深海沉積物中的適冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的主要蛋白酶。蛋白酶MCP-01前體由835個(gè)氨基酸殘基組成，該酶屬于絲氨酸蛋白酶S8家族subtilisin亞家族。Subtilisin中的蛋白酶成熟后絕大多數(shù)只含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，但MCP

4、-01的成熟酶包括催化結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)域、P結(jié)構(gòu)域和PKD結(jié)構(gòu)域四部分，是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的subtilisin，此類型蛋白酶被我們命名為Deseasin。本論文以蛋白酶MCP-01對(duì)膠原蛋白的降解作用為研究對(duì)象，對(duì)MCP-01的生化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制及其應(yīng)用基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，取得了如下研究結(jié)果。
　　 1.MCP-01及其各結(jié)構(gòu)域的異源表達(dá)體系的建立和分離純化
　　 MCP-01是一個(gè)典型的適冷蛋白酶，由于其具有多個(gè)結(jié)構(gòu)

5、域，熱穩(wěn)定性較差，在中高溫條件下容易發(fā)生自溶現(xiàn)象，常規(guī)的異源表達(dá)方法很難得到有活性的酶。建立適合MCP-01異源表達(dá)的條件對(duì)進(jìn)一步研究酶的結(jié)構(gòu)與功能顯得尤為重要。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MCP-01在大腸桿菌中的重組表達(dá)量較低。在成熟前MCP-01以不具有活性的酶原形式存在于重組菌內(nèi)。在50％海水LB培養(yǎng)基中經(jīng)15℃，200rpm誘導(dǎo)8天后MCP-01能夠分泌到重組菌胞外，并具有活性，但表達(dá)分泌量較低，為19.6U/ml。探索并優(yōu)化了MCP-0

6、1催化結(jié)構(gòu)域CD和C端PKD結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達(dá)和分離純化條件。最終確定重組蛋白CD的最佳產(chǎn)酶條件為：在50％海水LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)重組菌至OD600=2.0時(shí)添加0.05 mM IPTG，在15℃，200 rpm下誘導(dǎo)7天。從發(fā)酵液中利用陰離子交換層析和凝膠過濾層析分離純化有活性的CD重組蛋白，產(chǎn)量為64.8 U/ml。PKD的最佳誘導(dǎo)條件為：在LB培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)重組菌至OD600=1.2，添加0.5 mM IPTG，

7、在15℃，200 rpm下誘導(dǎo)48 h。由于誘導(dǎo)表達(dá)的PKD存在于重組菌的胞內(nèi)，利用超聲波破碎和谷胱甘肽融合蛋白親和層析法分離純化含GST標(biāo)簽的PKD重組蛋白，再經(jīng)凝血酶切割和谷胱甘肽親和層析得到電泳純的PKD。質(zhì)譜分析表明，純化后的CD和PKD重組蛋白的分子量與根據(jù)序列推算的分子量一致。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究酶的催化性質(zhì)和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.MCP-01催化膠原蛋白降解的底物特異性和酶學(xué)性質(zhì)
　　 通過分析蛋白酶

8、MCP-01對(duì)各種蛋白和合成肽類的降解效率，并與梭菌產(chǎn)的膠原蛋白酶的底物特異性進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶MCP-01能降解多種類型的膠原蛋白，特別是對(duì)海洋動(dòng)物來源的膠原蛋白具有很強(qiáng)的降解能力。除了對(duì)不溶的Ⅰ型膠原蛋白有很強(qiáng)的降解效率之外，MCP-01對(duì)于多種可溶性膠原蛋白都能降解，降解效率為明膠>酸溶Ⅰ型膠原蛋白>Ⅳ型膠原蛋白>Ⅱ型膠原蛋白。為了分析MCP-01對(duì)膠原蛋白的降解機(jī)制，用蛋白酶MCP-01酶解牛Ⅰ型膠原蛋白，電泳分離酶解片段

9、，通過N端測(cè)序分析了MCP-01在Ⅰ型膠原蛋白上的酶切位點(diǎn)。結(jié)果表明，MCP-01在牛Ⅰ型膠原蛋白上有多個(gè)特異性切點(diǎn)，這是首次闡明了一個(gè)細(xì)菌絲氨酸類膠原蛋白酶在膠原蛋白上的切點(diǎn)。其對(duì)膠原蛋白的降解方式與動(dòng)物來源的典型膠原蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在膠原蛋白上的酶切方式完全不同。以不溶的Ⅰ型膠原蛋白為底物，我們研究了MCP-01的各種酶學(xué)性質(zhì)。MCP-01在0℃下仍具有12.4％的膠原酶活，是目前唯一報(bào)道的適冷膠原蛋白酶。MCP-0

10、1在pH9.0的Tris-HCl緩沖液中的活性最高，在pH6.0-10.0緩沖體系中能保持60％以上的活性。Ca2+能夠顯著增強(qiáng)MCP-01的活力，而Zn2+、Ni2+、Cu2+和Fe2+顯著抑制MCP-01酶活。
　　 3.MCP-01的C端PKD結(jié)構(gòu)域?qū)δz原蛋白的結(jié)合能力和膨脹機(jī)制
　　 MCP-01的C端具有一個(gè)功能未知的PKD結(jié)構(gòu)域。PKD結(jié)構(gòu)域約由80-90個(gè)氨基酸殘基組成，最早在人體多囊性腎病致病蛋白中發(fā)現(xiàn)，

11、隨后陸續(xù)在一些微生物的幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和少數(shù)蛋白酶中發(fā)現(xiàn)。目前，其結(jié)構(gòu)已被結(jié)晶和解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管一級(jí)序列差異較大，但所有PKD都具有類似于抗體的β折疊結(jié)構(gòu)。到目前為止，PKD結(jié)構(gòu)域在蛋白酶中的功能一直沒有得到闡明。
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)，缺失PKD結(jié)構(gòu)域的MCP-01的CD能夠降解不溶的Ⅰ型膠原蛋白，但效率只有MCP-01全酶的60％左右。而用重組的PKD結(jié)構(gòu)域預(yù)先處理膠原蛋白，可以明顯提高M(jìn)CP-01的CD對(duì)膠原蛋白的降解

12、效率。這些結(jié)果表明MCP-01中的PKD結(jié)構(gòu)域在酶催化膠原蛋白降解的過程中可能發(fā)揮重要作用。在大腸桿菌中將PKD結(jié)構(gòu)域基因與綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)和分離純化，獲得了電泳純的融合蛋白PKD-EGFP。通過測(cè)定溶液中PKD-EGFP與膠原蛋白作用前后的熒光值，分析了PKD-EGFP與膠原蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果表明PKD結(jié)構(gòu)域?qū)Σ豢扇苣z原蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。為了分析PKD結(jié)構(gòu)域中起作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，首先通過序列比對(duì)分析了MCP-01的PKD

13、結(jié)構(gòu)域中的保守氨基酸殘基，然后構(gòu)建和表達(dá)了這些氨基酸殘基的點(diǎn)突變體，并分析了突變體對(duì)膠原蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果表明，PKD結(jié)構(gòu)域中36位的色氨酸殘基的突變使PKD結(jié)構(gòu)域?qū)δz原蛋白的結(jié)合能力幾乎完全喪失。而且利用圓二色譜對(duì)突變體的結(jié)構(gòu)分析表明，36位的色氨酸的突變沒有對(duì)PKD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。這些結(jié)果表明，36位的色氨酸殘基是PKD結(jié)構(gòu)域結(jié)合膠原蛋白過程中起關(guān)鍵作用的位點(diǎn)。
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PKD結(jié)構(gòu)域能夠?qū)е履z原蛋白的膨

14、脹，并且膨脹作用具有溫度依賴性。通過SEM觀察到PKD處理后的膠原蛋白直徑由5.3μm增加到8.8μm。通過AFM觀察到PKD結(jié)構(gòu)域能夠與膠原蛋白結(jié)合，導(dǎo)致膠原纖絲內(nèi)部發(fā)生解離和松散。Zeta電位結(jié)果表明，膠原蛋白表面帶有正凈電荷，經(jīng)PKD處理后，膠原蛋白表面的正凈電荷增多，說明PKD結(jié)構(gòu)域處理后能夠?qū)е履z原蛋白聚合體的解離。圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)PKD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合不會(huì)導(dǎo)致膠原三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也沒有對(duì)膠原三螺旋的熱穩(wěn)定性造成影響。由此，我

15、們提出了MCP-01對(duì)膠原蛋白降解的作用機(jī)制模型圖，與已報(bào)道的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP對(duì)膠原蛋白的降解機(jī)制不同。
　　 4.MCP-01催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)及其對(duì)膠原蛋白的催化機(jī)制
　　 目前對(duì)哺乳動(dòng)物基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的膠原蛋白催化機(jī)制研究較為詳細(xì)。MMP的催化腔較小，約有5 A左右，難以容納長(zhǎng)度為3，000 A，直徑為15 A的膠原蛋白纖維。MMP的Hxp結(jié)構(gòu)域能夠與三螺旋膠原蛋白結(jié)合，行使解旋酶作用，局部打開膠原蛋白

16、螺旋，使膠原蛋白結(jié)構(gòu)松散并露出單鏈，從而進(jìn)入MMP催化腔。但目前對(duì)細(xì)菌膠原酶對(duì)膠原蛋白的催化機(jī)制研究很少。
　　 蛋白酶MCP-01與MMP不同，其催化結(jié)構(gòu)域CD能夠單獨(dú)降解不可溶膠原蛋白底物，表明其催化腔可能能容納膠原蛋白三螺旋分子。但這并不是subtilisin家族蛋白酶的共同特征。該家族的模式蛋白酶Carlsberg以及其他許多酶都不具有降解膠原蛋白的功能。為了研究蛋白酶MCP-01催化降解膠原蛋白的機(jī)制，我們首先對(duì)蛋白酶

17、MCP-01的CD進(jìn)行了結(jié)晶，通過X-射線衍射得到了CD的分子結(jié)構(gòu)，分辨率為1.76 A，這是首次報(bào)道了一個(gè)絲氨酸家族膠原蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)。對(duì)CD的結(jié)構(gòu)分析表明，CD具有與Carlsberg相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和催化三聯(lián)體，但卻具有更大的催化腔，約17 A。通過分子模擬，我們發(fā)現(xiàn)CD催化腔可以容納直徑為15 A的膠原蛋白三螺旋分子。由于催化腔較大，底物進(jìn)入CD時(shí)不需要發(fā)生構(gòu)象變化。與之相比，Carlsberg的催化腔則較小，約13 A。通過分

18、析CD和膠原蛋白肽的復(fù)合物中CD催化腔和膠原蛋白肽的相互作用發(fā)現(xiàn)，催化腔外側(cè)的3個(gè)loop與酶的底物特異性有關(guān)，直接參與了酶對(duì)底物的捕獲。比較CD和Carlsberg的催化腔外側(cè)loop區(qū)發(fā)現(xiàn)，二者在這些loop區(qū)的氨基酸性質(zhì)及其側(cè)鏈長(zhǎng)度不同。CD的loop中含有較多的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。比較CD與已報(bào)道的其它S8家族絲氨酸膠原蛋白酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在這些膠原蛋白酶中也具有較保守的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。因此，它們可能是CD與

19、膠原蛋白相互作用的關(guān)鍵殘基。我們對(duì)這些氨基酸殘基進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并測(cè)定了突變體的膠原酶活和酪蛋白酶活，發(fā)現(xiàn)D140、D202、P210、P256、F177和E102等氨基酸殘基突變后，CD的膠原酶活力下降，因此這些殘基可能直接參與了CD與膠原蛋白的相互結(jié)合。這些研究結(jié)果初步闡明了CD降解膠原蛋白的分子基礎(chǔ)，并為闡明絲氨酸蛋白酶的功能進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 以上這些研究結(jié)果初步揭示了MCP-01對(duì)膠原蛋白的降解特性及機(jī)制。以M

20、CP-01為代表，Deseasin類蛋白酶可能在深海沉積物中廣泛存在并在深海PON的降解中發(fā)揮作用。我們的研究為進(jìn)一步闡明包括deseasin在內(nèi)的深海蛋白酶在深海沉積物HMWON的降解中發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)，并為開發(fā)具有新用途的蛋白酶奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 5.適冷蛋白酶MCP-01的肉類嫩化作用和嫩化機(jī)制
　　 膠原蛋白是肌肉結(jié)締組織的重要組成部分，約占80％，是影響肉質(zhì)嫩度的重要因素之一。MCP-01是目前唯一

21、報(bào)道的適冷膠原蛋白酶。由于其在低溫及室溫下具有很高的膠原蛋白活性，因此可能在低溫及室溫下具有很好的肉類嫩化能力。為此，以牛肉為樣品，我們研究了蛋白酶MCP-01對(duì)肉制品的嫩化能力和嫩化機(jī)制，并與目前商品化的嫩化酶木瓜蛋白酶Papain和菠蘿蛋白酶Bromelain進(jìn)行了比較。研究結(jié)果表明，在4℃下，經(jīng)MCP-01處理的牛肉的剪切力的下降幅度與經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的基本相同，表明MCP-01可能具有與菠蘿蛋白酶相似的肉類嫩化能力。MCP-0

22、1嫩化后的牛肉能保持新鮮色澤，具有較高的保水性，形狀基本不變，而木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶嫩化后的牛肉失水率高，形狀發(fā)生皺縮，顏色變暗。底物特異性研究表明，在4℃下，MCP-01降解膠原蛋白的能力明顯高于Bromelain和Papain，表明MCP-01在嫩化過程中能高效降解結(jié)締組織中的膠原蛋白。MCP-01與商品化的嫩化酶對(duì)牛肉肌細(xì)胞中的肌原纖維蛋白的選擇性降解能力不同。Bromelain和Papain能夠毫無選擇性地將牛肉的肌球蛋白重鏈