b.cereusmbl13u膠原蛋白酶分離純化及其降解牛骨膠原蛋白機理的研究

1、 分類號 U D C 密 級 編 號 碩士學(xué)位論文 碩士學(xué)位論文 B.cereus MBL13-U 膠原蛋白酶分離純化及其降解牛骨膠原蛋白機理的研究 Research on Separation and Purification of B.cereus MBL13-

2、U Collagenase and Its Mechanism for Degradation of Bovine Bone Collagen 學(xué)位申請人： 學(xué)位申請人： 李 丹 指 導(dǎo) 教 師 ： 指 導(dǎo) 教 師 ： 劉麗莉 劉麗莉 副教授 副教授 一 級 學(xué) 科 ： 一 級 學(xué) 科 ： 食品科學(xué)與工程 食品科學(xué)與工程 二 級 學(xué) 科 ： 二 級 學(xué) 科 ： 農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程 農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程 學(xué) 位 類 別 ： 學(xué)

3、位 類 別 ： 工學(xué)碩士 工學(xué)碩士 2017 年 05 月摘要 摘 要 牛骨骼中的 I 型膠原蛋白含量豐富， 但因得不到合理利用而造成巨大的浪費。因此，本研究采用前期從自然界篩選到高效降解牛骨膠原蛋白的蠟樣芽孢桿菌 B. cereus MBL13-U，通過發(fā)酵制備膠原蛋白粗酶，經(jīng)過一系列分離純化技術(shù)得到具有特異性降解牛骨 I 型膠原蛋白的酶 （Collagenase for specific bovine-bone collagen

4、 degradation，CSCD），將 CSCD 酶用于降解牛骨膠原蛋白，構(gòu)建降解過程的動力學(xué)模型，并對其降解牛骨膠原蛋白的機理進(jìn)行了初步探討，為牛骨骼的深加工利用奠定理論基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： （1）B. cereus MBL13-U 菌株發(fā)酵制備膠原蛋白酶的工藝優(yōu)化。通過單因素試驗研究了菌株接種量、反應(yīng)溫度、pH 值、反應(yīng)時間對膠原蛋白酶酶活的影響，在此基礎(chǔ)上以膠原蛋白酶酶活為指標(biāo)，通過四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，確定了發(fā)酵制備

5、膠原蛋白酶的最佳工藝參數(shù)為菌株接種量 4 mL/100mL， 反應(yīng)溫度 35 ℃，pH 值 6.4，反應(yīng)時間 46 h，在此條件下膠原蛋白酶酶活達(dá)到 92.31 U/mL。 （2）膠原蛋白酶的分離純化及特性分析。將菌株 B.cereus MBL13-U 粗酶液依次通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換層析、Sephadex G-100 凝膠層析，得到 CSCD 酶，分子量約為 52 kDa，純化倍

6、數(shù)達(dá)到 42.85 倍。通過對 CSCD 酶的酶學(xué)特性分析得出 CSCD 酶的最適溫度為 50 ℃， 在低于 50 ℃的中低溫環(huán)境中熱穩(wěn)定性良好，但在相對高溫的條件下穩(wěn)定性較差；最適 pH 值為 6.5，pH 在 5.5-7.5 的條件下相對穩(wěn)定，不適于強酸或堿性環(huán)境；CSCD 酶能夠特異性降解牛骨 I 型膠原蛋白，與其他蛋白酶相比，其對牛跟腱 I 型膠原蛋白的作用最為顯著。 （3） CSCD 酶降解牛骨膠原蛋白的工藝優(yōu)化。通過單因素試

7、驗研究了反應(yīng)溫度、 牛骨粗膠原蛋白添加量、 CSCD 酶添加量、 反應(yīng)時間、 pH 值對水解度的影響，在此基礎(chǔ)上以水解度為指標(biāo)，通過五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，確定了 CSCD 酶降解牛骨膠原蛋白的最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度 46 ℃， 牛骨粗膠原蛋白添加量 5.14 g/100mL，CSCD 酶添加量 0.42 g/100mL，反應(yīng)時間 6 h，pH 值 6.5，在此工藝條件下水解度為 31.21%。 （4） CSCD 酶降解牛骨膠原蛋白的