通過體外分子進化技術提高淀粉液化芽孢桿菌BS5582β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、β-1,3-1,4-葡聚糖屬植物細胞壁的結構性非淀粉多糖,是以混合(1→3)和(1→4)β-糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物,在大麥整粒和胚乳中含量高達4.0％-8.0％。Β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)能有效水解β-1,3-1,4-葡聚糖,主要產物為三糖(3-O-β-D-纖維二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纖維三糖-D-葡萄糖)。在啤酒工業(yè)中,β-葡聚糖酶可降低麥汁粘度,提高麥汁濾速及得率,改善啤酒風味,

2、保持成品酒穩(wěn)定性。目前市售β-葡聚糖酶多為用于飼料加工的粗酶制劑,酶熱穩(wěn)定性較差。啤酒工業(yè)使用復合酶中的β-葡聚糖酶溫度穩(wěn)定性范圍也較窄,從而限制了啤酒糖化工藝和啤酒工業(yè)的發(fā)展。因此,為適應行業(yè)發(fā)展需要,迫切需要開發(fā)耐高溫的β-葡聚糖酶,提高我國啤酒產業(yè)的國際競爭力。
　　 本研究首先應用基于易錯PCR隨機突變的體外定向進化技術,來提高淀粉液化芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。利用建立的基于96微孔板高通量篩選模型

3、,經過兩輪定向進化與高通量篩選,共篩選得到三株熱穩(wěn)定性明顯提高突變體2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。將野生型β-葡聚糖酶基因和熱穩(wěn)定性提高的突變基因的高效表達產物經鎳親和層析柱純化后,酶學性質測定表明突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分別比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2.60℃(min)分別比野生

4、酶(18 min)提高4 min,13 min和17 min。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值為286μmol/(mg·min),304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分別比野生型下降8.3％,2.6％和10.6％。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分別為6.76 mg/mL、6.19μmg/mL和6.84 mg/mL,與野生型(6.29mg/mL)

5、基本相同。序列分析表明,三個突變體共發(fā)生7個氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R),2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7個氨基酸替代中5個位于蛋白質表面或表面洞穴中,42.8％的替代氨基酸是精氨酸,表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性中起重要的作用。
　　 本研究基于PyMOL軟件,將定向進化得到的多株突變體所包含的氨基酸突變,

6、逐一進行單點突變,并借助foldX軟件對各個含有單一突變位點的酶蛋白變種逐一進行分子修復和分子自由能(△G)計算,根據(jù)分子自由能與熱穩(wěn)定性負相關的關系,七個氨基酸突變中,野生型β-葡聚糖酶第156位由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸后,酶蛋白分子的自由能由野生型的15.80 kcal/moL下降至14.28 kcal/moL,下降9.6％,在所有突變中下降幅度最大。本研究基于四引物PCR介導的定點突變技術,將野生型β-葡聚糖酶156位的谷氨酸突變?yōu)槔i