大麥(1,3-1,4)-β-葡聚糖分解與合成相關(guān)基因的克隆及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、大麥(Hordeum vulgare L.)是世界第四大谷類(lèi)作物，種植范圍和用途極為廣泛。近十年來(lái)，大麥轉(zhuǎn)基因研究取得了很大進(jìn)展，在大麥的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域取得了很多有積極意義的成果。本論文概述了大麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展及其實(shí)際應(yīng)用，大麥(1，3-1，4)-β-葡聚糖的功能、合成與分解機(jī)制等相關(guān)研究進(jìn)展，并在上述基礎(chǔ)上，以建立快速、高效實(shí)用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系和通過(guò)反向遺傳學(xué)方式探索調(diào)控大麥β-葡聚糖含量的途徑為主要目的

2、，克隆了大麥(1，3-1，4)-β-葡聚糖水解酶基因和纖維素合成類(lèi)酶基因，并分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化研究，獲得了如下主要結(jié)果：
　　 1．克隆大麥(1，3-1，4)-β-葡聚糖水解酶基因(EC3.2.1.73)的兩個(gè)同工酶基因EⅠ與EⅡ的全長(zhǎng)CDS序列(1005bp)，并利用酶切連接方法，構(gòu)建了pCAMBIA1301-35S:EⅡ過(guò)表達(dá)載體(1301E)；利用基因組PCR克隆大麥谷蛋白Hor-D啟動(dòng)子，

3、構(gòu)建了pCAMBIA1301-Hor-D:EⅡ胚乳與根部特異性過(guò)表達(dá)載體(1301DE)，這兩個(gè)載體均用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 2．以大麥Golden Promise未成熟胚為受體材料，采用用農(nóng)桿菌侵染和固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的方法，進(jìn)行了大麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，確定了各個(gè)步驟的操作方法和注意事項(xiàng)。獲得6株1301DE轉(zhuǎn)基因再生植株，轉(zhuǎn)化效率為3％，最后得到一個(gè)T1株系；通過(guò)Southern blot檢測(cè)，確定目的基因在T1株

4、系為單拷貝；通過(guò)PCR，證實(shí)目的基因在T1植株中的分離符合孟德?tīng)栠z傳定律；利用RT-PCR，檢測(cè)到EⅡ mRNA在T1植株根部有表達(dá)。
　　 3．利用RT-PCR克隆了大麥纖維素合成類(lèi)酶基因HvCslF4，并利用Gateway(R)載體系統(tǒng)構(gòu)建了pH7WG2D-35S:Hv4過(guò)表達(dá)載體，采用用農(nóng)桿菌侵染和液體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的方法進(jìn)行了大麥遺傳轉(zhuǎn)化，但是沒(méi)有獲得轉(zhuǎn)基因苗。
　　 4．固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)的農(nóng)桿

5、菌侵染大麥遺傳轉(zhuǎn)化步驟和過(guò)程的探索為建立高效實(shí)用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了有用的數(shù)據(jù)，同時(shí)，Hor-D:EⅡ轉(zhuǎn)基因株系的獲得，為利用反向遺傳學(xué)方法降低大麥胚乳(1，3-1，4)-β-葡聚糖的含量提供了潛在的研究基礎(chǔ)。接下來(lái)還需要進(jìn)一步的深入開(kāi)展研究，建立更加高效的大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，并研究轉(zhuǎn)入基因?qū)Υ篼?1，3-1，4)-β-葡聚糖含量的影響方式和作用機(jī)理，從而為大麥分子育種提供有力的支持，推動(dòng)大麥反義遺傳學(xué)研究的發(fā)展，最終為提升