蛋白酶抑制劑的制備及其抑制狹鱈魚糜凝膠劣化的研究.pdf

1、魚糜是一種經(jīng)粉碎和漂洗后，主要由可溶性肌原纖維蛋白組成的魚肉制品。魚糜中殘留的蛋白酶可引起魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致魚糜制品品質(zhì)及商業(yè)價值的下降。蛋白酶抑制劑可用于抑制魚糜凝膠的降解。本研究選取鮭魚的卵和血漿作為原材料以提取蛋白酶抑制劑。通過酸處理、超濾濃縮和木瓜蛋白酶親和柱純化，從鮭魚卵中純化出了一種cysmtin，其純化回收率、比活力和純化倍數(shù)分別為0.4％、1.54 U/mg和192.6倍。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)其分子量為13

2、 kDa。氨基酸測序發(fā)現(xiàn)其N-末端為N-Gly-Leu-Ile-Gly-Gly-Pro-Met-Asp-Ala-Asn-C，該序列與鮭魚其它組織中的cystatin的組成完全一致。通過使用木瓜蛋白酶親和柱，從鮭魚血漿中純化出了一種kiniongen，該純化的回收率、比活力和純化倍數(shù)分別為0.94％、3.84 U/mg和30.36倍。SDS-PAGE與FPLC的檢測表明其分子量為70 kDa。抑制活性染色表明，該抑制劑僅在非還原條件下可檢

3、出。PAS染色表明該抑制劑屬于糖蛋白。 以木瓜蛋白酶作為目標(biāo)酶，鮭魚卵cystatin的抑制能力最強；鮭魚血漿kiniongen的抑制能力高于玻璃魚卵抑制劑I、池沼公魚抑制劑和另一種鮭魚卵抑制劑；以組織蛋白酶L作為目標(biāo)酶，鮭魚卵cystatin的抑制能力略低于玻璃魚卵抑制劑Ⅱ，高于其他抑制劑；鮭魚血漿kininogen的抑制能力高于狹鱈卵抑制劑、玻璃魚卵抑制劑Ⅰ和鮭魚卵抑制劑。鮭魚卵cysmtin和鮭魚血漿kininogen具有

4、廣范圍的酸堿和熱穩(wěn)定性。在pH 5-8的范圍內(nèi)，鮭魚卵cystaitn的活性幾乎無損失。在pH 6-9的范圍內(nèi)，鮭魚血漿kininogen可保留60％以上的抑制活力。鮭魚卵cystatin在70°C以下處理30 min，可保留大于50％的活性。鮭魚血漿kininogen在60°C處理30 min，可保留50％的活性。鮭魚卵cystatin與鮭魚血漿kininogen主要在20-50°C的范圍內(nèi)表現(xiàn)出抑制活性。Dixon-plot作圖發(fā)現(xiàn)

5、，鮭魚卵cystatin屬于競爭性抑制劑，其抑制常數(shù)為2.12nM；鮭魚血漿kininogen屬于非競爭性抑制劑，其抑制常數(shù)為105.32 nM。 通過合成編碼鮭魚卵cystatin的DNA，采用pYES2NT/C質(zhì)粒，以啤酒酵母YPH 499為宿主，進行了鮭魚卵cystatin的重組表達。誘導(dǎo)表達后，分別使用選擇性鎳親和柱和乙醇沉淀法進行重組cystatin的純化，其中親和純化的回收率、比活力和純化倍數(shù)分別為61.23％、7.

6、45 U/mg和5.60倍。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，重組cystatin的分子量為35 kDa，推測其發(fā)生了雙體交聯(lián)。與天然鮭魚卵cystatin相比，重組cystatin的抑制活力有所下降，在酸性范圍內(nèi)的穩(wěn)定性也有所下降，但其熱穩(wěn)定性得以增強。采用響應(yīng)面法進行了搖瓶規(guī)模啤酒酵母YPH 499生產(chǎn)重組cystatin的優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基pH為5.7，誘導(dǎo)時間為6.7 h，誘導(dǎo)輔助劑的添加量為5.6g/L時，重組cystatin的產(chǎn)

7、量最大，可達0.57U/mL。該研究結(jié)果與重復(fù)實驗結(jié)果相一致。在搖瓶優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，進行了發(fā)酵罐中攪動速率和通氣速率影響啤酒酵母YPH 499生產(chǎn)重組cystatin的優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)在350 rpm的攪動速率結(jié)合1.0 vvm的通氣速率的發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中重組cystatin產(chǎn)量達到最大，為0.56U/mL。該研究結(jié)果與重復(fù)實驗結(jié)果相一致。 將純化的重組cystatin添加到狹鱈魚糜中，進行了魚糜凝膠劣化的抑制研究。親和純化

8、的重組cystatin，添加量為100 μg/g時，其對魚糜凝膠劣化的抑制率可達到90％以上。在該添加劑量下，凝膠的破碎力和變形量分別增加了4.5倍和30％。同時，其可榨出水分含量由17.85％減至6.27％，白度由49.78增加至52.60。SDS-PAGE檢測表明，通過添加重組cystatin，可顯著抑制蛋白酶引起的肌球蛋白的降解。重組cystatin的抑制效果顯著強于蛋清粉。醇沉純化的重組cystatin也可有效抑制魚糜凝膠劣化，