果蠅SNARE蛋白Sec22對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:真核細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸對(duì)于細(xì)胞的多種生命活動(dòng)至關(guān)重要并受到精密調(diào)節(jié)。膜泡運(yùn)輸?shù)漠惓?huì)導(dǎo)致發(fā)育障礙和多種人類(lèi)疾病。本研究以果蠅為模式生物，首先用甲磺酸乙酯(EMS)誘變法處理果蠅，篩選到了影響細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸?shù)腟ec22突變體，進(jìn)而探討了SNARE蛋白Sec22在果蠅細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸中的調(diào)節(jié)作用，首次揭示了Sec22的在體功能。
　　方法:利用FRT/FLP系統(tǒng)在突變體果蠅脂肪體中制造并標(biāo)記突變克隆，并在脂肪體中用GFP標(biāo)記膜泡運(yùn)輸

2、中的轉(zhuǎn)運(yùn)小泡和細(xì)胞器。激光共聚焦顯微鏡下觀察對(duì)比突變克隆細(xì)胞與野生型細(xì)胞中GFP的差異;然后利用eyFLP/FRT系統(tǒng)在果蠅眼睛中制造突變克隆，并借助電鏡觀察突變細(xì)胞內(nèi)膜泡數(shù)量變化和形態(tài)特征:最后采用免疫共沉淀法揭示Syntaxin5、Eyc和Sec22三者之間的關(guān)系，探尋Sec22作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)我們篩選到X染色體純合致死的突變基因Sec22，該基因突變體果蠅死于胚胎期。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，Sec2

3、2突變細(xì)胞中積累大量的KDEL-GFP(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))、Rab7-GFP（晚期內(nèi)涵體）和LAMP-GFP（溶酶體），MANⅡ-GFP標(biāo)記的高爾基體形態(tài)異常。(3)電鏡的結(jié)果顯示，Sec22突變體眼睛光感受細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，rhabdomere之間有融合現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度增生。并且Syntaxin5 RNAi以及已報(bào)道過(guò)的Eyc過(guò)表達(dá)果蠅眼睛的表型與Sec22突變體表型極為相似。(4) Syx5與Sec22有相互作用，Sec22