反式茴腦微生物降解和轉(zhuǎn)化合成茴香醛和茴香酸.pdf

1、八角是廣西盛產(chǎn)的天然香料資源,八角茴香油(簡(jiǎn)稱(chēng)茴油)是從八角果、枝和葉中提取的一種芳香精油,其中反式茴腦含量為80％～90％。反式茴腦是具有丙烯基苯結(jié)構(gòu)的化合物,通常作為化學(xué)法合成香料的起始原料。微生物在降解丙烯基苯化合物的過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物大部分都是具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的芳香族化合物。利用微生物轉(zhuǎn)化反式茴腦極有可能獲得茴香醛、茴香酸等高附加值的天然生物香料。因此本課題選擇反式茴腦為底物,篩選能降解并轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醛或茴香酸的微生物

2、;同時(shí)對(duì)影響轉(zhuǎn)化的因素、生物降解中間產(chǎn)物的分離鑒定以及反式茴腦的生物降解途徑進(jìn)行了探討。
　　 一、反式茴腦生物降解和轉(zhuǎn)化體系的分析方法建立
　　 建立了分析反式茴腦降解和轉(zhuǎn)化體系中反式茴腦和產(chǎn)物茴香醛、茴香酸的薄層層析法(TLC法)、薄層層析-紫外分光光度法(TLC-UV法)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)和硫代巴比妥酸分光光度法(TBA法)。TLC法選用的適宜展開(kāi)劑配方為石油醚(bp.60℃～90℃):氯仿:

3、乙酸乙酯:甲酸(V/V/V/V):25:10:3:0.2,該法能同時(shí)定性和半定量分析反式茴腦、茴香醛和茴香酸,操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)快速,適合于生物降解和轉(zhuǎn)化反式茴腦菌株的快速篩選。TLC-UV法和RP-HPLC法可同時(shí)定量分析反式茴腦、茴香醛和茴香酸三元混合體系,RP-HPLC法測(cè)定的準(zhǔn)確性高于TLC-UV法。適宜的RP-HPLC法條件為:采用Kromasil-100AC18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm),流動(dòng)相為V(乙腈):V(水

4、):V(冰醋酸)=70:30:0.02,等度洗脫,流速0.8mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,進(jìn)樣量5μL,柱溫室溫。此外,還可根據(jù)需要采用硫代巴比妥酸分光光度法定量測(cè)定樣液中的茴香醛,反式茴腦和茴香酸對(duì)茴香醛的測(cè)定幾乎沒(méi)有影響。
　　 二、生物降解反式茴腦的微生物篩選及鑒定
　　 通過(guò)從廣西高峰林場(chǎng)八角種植區(qū)土樣、八角植物內(nèi)生菌、八角加工車(chē)間廢液中篩選耐受高濃度茴油的微生物,并檢驗(yàn)菌株降解反式茴腦合成茴香醛或茴香

5、酸的能力。用逐級(jí)添加茴油的富集培養(yǎng)方法從土樣中獲得了一株能夠在1％(V/V)茴油濃度下生長(zhǎng)的菌株BT-13,確定其在改良M9培養(yǎng)基上,一定的轉(zhuǎn)化條件下,具有高轉(zhuǎn)化反式茴腦的能力,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以茴香酸為主。菌株BT-13根據(jù)其形態(tài)特征觀察、部分生理生化特性和16SrDNA序列同源性比較,鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。從新鮮八角果、枝、葉中分離到87株內(nèi)生菌,其中真菌69株,細(xì)菌18株。有一株內(nèi)生細(xì)菌BZ-15對(duì)反式茴腦降解

6、能力較強(qiáng),可檢測(cè)到茴香酸的生成。該菌經(jīng)16SrDNA序列同源性比較,鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。從八角加工車(chē)間廢液中篩選獲得了一株具有較強(qiáng)降解反式茴腦能力并轉(zhuǎn)化合成少量茴香醛的真菌菌株ZJ-9,通過(guò)對(duì)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征的觀察,對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》,鑒定該真菌為黑曲霉。
　　 三、微生物轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醛和茴香酸工藝研究
　　 研究了假單胞菌BT-13在有機(jī)溶劑-水兩相體系中生物轉(zhuǎn)化反式

7、茴腦合成茴香醛的條件。首先考察了在搖瓶條件下,有機(jī)溶劑極性和加入量、培養(yǎng)基配方、轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量以及pH值等條件對(duì)游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成茴香醛的影響。結(jié)果表明,適宜有機(jī)溶劑為乙酸乙酯,加入量控制在10％(V/V)。適宜的培養(yǎng)基為改良馬丁氏培養(yǎng)基,培養(yǎng)方式為搖床培養(yǎng)。在裝液量為20mL/150mL三角瓶,培養(yǎng)基初始pH控制在6.5,溫度30℃,轉(zhuǎn)速150r·min-1,轉(zhuǎn)化時(shí)間30h,茴香醛的摩爾生成率為7.7％。接著在此兩

8、相體系中采用海藻酸鈣固定化細(xì)胞對(duì)反式茴腦進(jìn)行轉(zhuǎn)化,茴香醛的摩爾生成率可提高至12.6％。為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化液中未轉(zhuǎn)化的反式茴腦和茴香醛的分離,轉(zhuǎn)化液首先用等體積的乙酸乙酯萃取,取上層有機(jī)相,接著在有機(jī)相中加入飽和亞硫酸氫鈉將茴香醛反萃到水相,再將水相茴香醛加成物酸化成醛的形式,最后用乙酸乙酯萃取可得到茴香醛。
　　 開(kāi)展了假單胞菌BT-13在改良M9培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香酸的條件優(yōu)化,考察了培養(yǎng)基配方、底物加入量、搖床轉(zhuǎn)速、溫度和

9、培養(yǎng)基初始pH值對(duì)茴香酸生成的影響。結(jié)果表明:在改良M9培養(yǎng)基中添加碳源的濃度高于1g·L-1時(shí),明顯抑制反式茴腦的轉(zhuǎn)化。生成茴香酸的優(yōu)化條件是,培養(yǎng)基配方為麥芽糖0.5g·L-1,NH4Cl0.5g·L-1,FeSO4·7H2O0.01g·L-1,MgSO4·7H2O2.0g·L-1,NaCl0.5g·L-1,Na2HPO46.8g·L-1,KH2PO43.0g·L-1,CaCl20.02g·L-1;反式茴腦加入量為9.83g·L-1

10、,搖床轉(zhuǎn)速為200r·min-1,轉(zhuǎn)化溫度為30℃,轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的初始pH為7.0。在優(yōu)化條件下,茴香酸積累的濃度為3.49g·L-1,摩爾生成率為34.6％,比優(yōu)化前結(jié)果提高了92.8％。假單胞菌BT-13轉(zhuǎn)化反式茴腦的主要產(chǎn)物為茴香酸,還含有茴香醛、茴香二醇等中間產(chǎn)物。利用5L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn),茴香酸濃度最高可達(dá)3.57g·L-1,摩爾生成率為36.1％。轉(zhuǎn)化液經(jīng)酸化、乙酸乙酯萃取、真空濃縮和結(jié)晶可得到針狀的茴香酸晶體。

11、r>　　 四、反式茴腦在假單胞茵B(yǎng)T-13和黑曲霉ZJ-9作用下的可能降解途徑
　　 采用高效液相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用等手段分析假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦的中間產(chǎn)物,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比對(duì)或GC-MS圖譜分析確定了假單胞菌BT-13降解反式茴腦四種中間產(chǎn)物,分別為茴香環(huán)氧化物、茴香二醇、茴香醛和茴香酸;黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦五種中間產(chǎn)物,分別為茴香環(huán)氧化物、茴香二醇、茴香醇、茴香醛和茴香酸,且在一定條

12、件下,茴香醇有一定程度的積累。這些中間產(chǎn)物中茴香醇、茴香醛和茴香酸在香料和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中是高附加值的芳香族化合物。根據(jù)中間產(chǎn)物的生成情況,推測(cè)了這兩種菌降解反式茴腦的可能途徑。假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦的共同可能途徑:反式茴腦首先在丙烯基側(cè)鏈雙鍵處加氧,形成茴香環(huán)氧化物,環(huán)氧化物水解后形成茴香二醇,進(jìn)一步氧化生成茴香醛、茴香酸。在黑曲霉ZJ-9中,茴香醛還可以被還原生成茴香醇。兩種菌都通過(guò)形成茴香二醇途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)反式茴腦的

13、降解,但在某些中間產(chǎn)物積累上存在差異。
　　 假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9胞內(nèi)酶中檢測(cè)到過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性。假單胞菌BT-13胞內(nèi)檢測(cè)的POD和CAT酶活最高分別為122U·mL-1和625U·mL-1,黑曲霉ZJ-9胞內(nèi)檢測(cè)的POD和CAT酶活最高分別為4.8U·mL-1和42.5U·mL-1,明顯低于假單胞菌BT-13。從檢測(cè)的酶活結(jié)果和兩株菌降解反式茴腦中間產(chǎn)物的積累情況,得出黑曲霉ZJ