重組釀酒酵母中CIT2基因的敲除及對其木糖代謝的影響.pdf

1、能源短缺是目前全世界共同面臨的重大問題之一。在我國能源狀況日益緊迫的背景下，生物乙醇燃料的推廣與使用顯得尤為重要，對我國能源結(jié)構(gòu)進行調(diào)整已成為能源發(fā)展面臨的重要任務(wù)之一。用于生產(chǎn)生物乙醇燃料的原料主要是淀粉類、糖類或纖維類，秸稈類纖維素物質(zhì)具有木質(zhì)纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其中半纖維素構(gòu)成了秸稈類纖維素物質(zhì)中的相當部分約為30％，其水解產(chǎn)物是D-木糖類的五碳糖。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以利用淀粉質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

2、，卻不能直接以纖維素為底物進行發(fā)酵，原因是纖維素的水解需要三種相互配合分解纖維素的酶，如在有氧條件下可進行有氧呼吸，在厭氧條件下可進行產(chǎn)乙醇的無氧呼吸，并且已測定其全基因組序列，有對其成熟的基因操作認識，因此被作為工業(yè)上用于發(fā)酵乙醇的常用微生物。但是釀酒酵母卻不能直接代謝利用木糖，因其沒有專一性代謝木糖生成木酮糖的酶系并且存在細胞膜上木糖跨膜運輸障礙，只有在釀酒酵母中引入木糖代謝流并利用木酮糖的代謝酶系，將其代謝分解隨后進入磷酸戊糖途徑

3、，從而進入其本身的代謝流，解決了在釀酒酵母中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過程中木糖轉(zhuǎn)、代謝問題。
　　 本實驗室對已構(gòu)建好具有木糖利用功能的釀酒酵母C5D-P-M，研究發(fā)現(xiàn)在重組可利用木糖的釀酒酵母中DUP240家族中的檸檬酸鹽類合成酶基因CIT2對木糖利用具有某種程度的影響。利用基因芯片與基因敲除技術(shù)對已構(gòu)建好的釀酒酵母進行分析與敲除CIT2基因獲得突變株C5D-P-M-CIT2Δ釀酒酵母。并比較實驗菌株與對照菌株在生理生化與熒光定量結(jié)

4、果中的差異。
　　 通過綜合比較C5D-P-M-CIT2Δ與對照菌在生理生化與熒光定量分析結(jié)果中的差異，最終實驗菌株C5D-P-M-CIT2Δ生長速率平均增速是對照菌株的1.272倍，每12h多增加CO2的產(chǎn)量是0.0798g，表明CIT2基因?qū)︶劸平湍咐媚咎蔷哂胸撜{(diào)控作用。平均乙醇產(chǎn)量是對照菌的1.098倍。通過葡萄糖與木糖剩余量的測定結(jié)果，對葡萄糖的利用效率要略高0.2g/ml，對木糖的利用能力要略強，前8個小時木糖的利用

5、率是對照菌的2.222倍，8小時以后是1倍，表明釀酒酵母中CIT2基因敲除后主要影響的是糖運輸過程，并且此基因?qū)μ沁\輸過程是抑制與阻礙作用。由于糖代謝過程是受糖運輸過程影響，當有豐富糖源供給時會增強糖代謝流向下游進行，但當糖代謝過程達到一定程度后糖運輸對糖代謝的推動作用就會不明顯。通過熒光定量PCR技術(shù)對木糖代謝利用中的相關(guān)基因進行分析，最終得知實驗菌株C5D-P-M-CIT2Δ在木糖代謝流中的相關(guān)基因XYL1、XYL2、GND1、TK