茶葉非淀粉多糖的分離制備、功能特性及降糖機制研究.pdf

1、目前關(guān)于茶多糖的分離純化及降血糖作用研究較多,但對其可能的降糖機制,及進入動物機體后如何消化吸收及分布的報道還很少。本文以杭州西湖龍井產(chǎn)的粗老茶葉為原料,研究了水溶性茶多糖的提取工藝,制備方法;茶多糖體內(nèi)外抗氧化活性,并探討了茶多糖可能的降血糖機制;考察了茶多糖在體內(nèi)外的動態(tài)分布特性和規(guī)律;研究了不同處理工藝和粒徑大小對茶葉不溶性非淀粉多糖營養(yǎng)成分及理化功能性質(zhì)的影響。主要結(jié)論如下:
　　1.通過單因素實驗和正交實驗,對四個因素(

2、溫度、提取次數(shù)、時間、液料比)進行分析發(fā)現(xiàn),提取效果影響依次為提取溫度>提取次數(shù)>時間>液料比。茶多糖的最佳提取的工藝條件:料比為40:1、時間為2.5h、溫度100℃、提取次數(shù)為3次,茶多糖得率可達到4.4％。
　　2.分別采用水法和堿法制備不同種類的不溶性茶葉非淀粉多糖(INSP),測定其營養(yǎng)成分及兩種提取方式下不同粒徑的水合能力(包括結(jié)合水力、持水性、膨脹率)和吸附性能(包括持油性、膽酸鹽、亞硝酸根離子吸附能力)。結(jié)果表明:

3、2種工藝制備的INSP間營養(yǎng)成分存在一定差異,尤其是影響其理化性質(zhì)的氨基糖與碳水化合物。其中堿法制備的茶葉非淀粉多糖(INSP2)中氨基糖與碳水化合物含量分別是水法制備的茶葉非淀粉多糖(INSP1)的1.50倍與1.35倍;堿法工藝制備的INSP2中的氨基糖殘留比較多;堿法工藝制備的INSP2中粗蛋白含量低,INSP1中是INSP2的7.09倍,說明處理工藝對茶葉INSP的理化性質(zhì)亦產(chǎn)生較大影響。適度堿處理獲得的INSP的水合能力與吸附

4、性均優(yōu)于水處理,其中膨脹率、持水力與結(jié)合水力分別為水處理的1.22、1.11、1.20倍。茶葉不溶多性多糖的功能特性與粉碎粒徑有很大的相關(guān)性。茶葉不溶多性多糖的結(jié)合水能力、持油性與吸附膽酸鈉能力在ITP250時其功能都是最大的。當(dāng)粉碎粒徑為ITP100到ITP200時持水能力與吸附能力均表現(xiàn)下降趨勢,但變化趨勢不完全一致,原因有待進一步分析。
　　3.采用酒精分級醇沉的方法,利用不同酒精濃度的分級醇沉粗多糖(CP),得到四種組分(

5、TPF30,TPF50,TPF70和 TPF90),其不同組分多糖含量分別是0.06mg/g,0.82mg/g,0.33mg/g和0.17mg/g,并用高效液相色譜(GC)法分析了其單糖組成,實驗結(jié)果這四種組分均含有鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸,但組成比各不相同。這說明分子量不同,組成成分比不同,可能會有不同的功能性質(zhì)。研究從粗茶多糖中分離得到的四個組分的抗氧化活性和降血糖功能。研究發(fā)現(xiàn)茶多糖的自由基清除

6、能力與溶液濃度有很大的正相關(guān)性。四個組分的清除自由基的能力均隨多糖溶液濃度(0.1到1.0 mg/ml)的升高而變強。當(dāng)茶多糖溶液濃度達1.0 mg/ml時, CP,TPF30, TPF50,TPF70和TPF90的羥基自由基清除能力分別是37.44%,45.91%,22.24%,56.36%和74.39%。DPPH清除能力分別是45.26%,44.08%,30.00%,32.37%和44.26%。還原能力分別是69.30%,57.67

7、%,81.17%,37.07%和101.40%。金屬螯合能力分別為10.38%,4.30%,7.02%,21.14%和34.15%。其中組分TPF70和TPF90均具有較好的清除自由基能力。
　　選用 ALX糖尿病模型小鼠檢測了粗茶多糖中分離得到的四個組分的降血糖效果。結(jié)果顯示TPF50, TPF70和TPF90均有不同程度的降血糖效果,它們的高劑量組(300mg/kg)的降糖效果與陰性組相比,分別降低的了60.8%,64.3%,

8、54.3%,降糖效果顯著(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。
　　4.同時綜合考慮,以四個分級組分的得率、抗氧化效果和降糖效果為指標(biāo),篩選了TPF70組分,進行下一步的研究。TPF70根據(jù)分子篩純化等到較純的組分TPF70-a,用于糖尿病小鼠的體內(nèi)抗氧化實驗。結(jié)果表明,茶多糖和陽性對照組小鼠的血清 GSH水平顯著高于陰性對照組(P<0.05、P<0.01)。肝臟中,茶多糖治療組小鼠的肝臟中GR水平顯著高于陰性對照組(

9、P<0.05),GSH水平也顯著高于陰性對照組(P<0.01)。陰性對照組 MAD指標(biāo)與陽性組差異顯著(P<0.05),陰性對照組SOD、CAT與茶多糖治療組差異顯著(P<0.05)。陰性對照組小鼠肝臟中 LPS含量與茶多糖治療組差異顯著(P<0.001),與陽性對照組(P<0.01)差異顯著,與空白組(P<0.05)。茶多糖治療組和陽性對照組肝糖原含量顯著高于陰性組(P<0.01,P<0.05)。此結(jié)果表明,茶多糖治療組和陽性對照組都

10、具有較好的體內(nèi)抗氧化效果。同時觀察小鼠的肝臟、腎臟組織切片,可以明顯看出茶多糖治療組和陽性對照組的肝細(xì)胞的腫脹情況明顯改善,索狀結(jié)構(gòu)變得較清楚。觀察小鼠胰島切片,可以發(fā)現(xiàn)陰性對照組的胰臟切片,胰島發(fā)生損傷,排列不整齊。胰島細(xì)胞體積變小,β細(xì)胞顆粒脫失,變空泡,出現(xiàn)水腫,胞漿內(nèi)基質(zhì)變得較為透明,無法染色。茶多糖治療組和陽性對照組的胰島細(xì)胞有很大程度的改善,胞漿內(nèi)有紫紅色顆粒。說明茶多糖治療糖尿病小鼠后能明顯延緩糖尿病引起的肝臟、腎損傷。陽

11、性對照組的胰島形態(tài)基本恢復(fù)正常。說明茶多糖治療對糖尿病胰島有修復(fù)作用。說明多糖的降血糖機制有可能是調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶系統(tǒng)。
　　5.通過模擬茶多糖在人工胃環(huán)境蠕動情況,對茶多糖在胃中的表現(xiàn)進行解析。發(fā)現(xiàn)茶多糖在體外模擬人工胃液的環(huán)境中,隨反應(yīng)時間的延長,還原糖的含量也隨之緩慢增加。從10min到60min,還原糖含量增加迅速,60min后增加緩慢。從10 min開始就有小分子化合物出現(xiàn),隨作用時間延長大分子多糖出現(xiàn)明顯變化,分子量下

12、降明顯,出現(xiàn)許多小分子片段。表明茶多糖在體外模擬人工胃液的環(huán)境中隨時間作用會發(fā)生不同程度的降解,產(chǎn)生還原糖和寡糖片段。采用熒光胺標(biāo)記技術(shù),標(biāo)記分級純化后的茶多糖,并建立熒光標(biāo)記多糖定量分析方法。追蹤不同給藥方式,不同時間段,其在小鼠胃腸道內(nèi)及小鼠血漿中分布的動態(tài)變化規(guī)律,結(jié)果顯示不同的給藥方式在體內(nèi)的動態(tài)分布差異明顯?？赡苁且驗椴瓒嗵墙?jīng)腹腔注射和口服的代謝途徑有很大的差異,腹腔注射相對于灌胃起效快。灌胃的方式效果較緩慢,但在體內(nèi)作用時間