擬威克酵母利用中等碳鏈長度烷烴合成槐糖脂的研究.pdf

1、生物表面活性劑主要是微生物在一定條件下培養(yǎng)時，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物。生物表面活性劑與化學合成表面活性劑性能相似，但相比之下，生物表面活性劑可生物降解，具有較好的環(huán)境相容性，無毒或低毒，結(jié)構(gòu)多樣，可適用于多種環(huán)境。因此對生物表面活性劑已進行廣泛的研究，并極有可能替代化學合成的表面活性劑。
　　 槐糖脂是一種重要的糖脂類生物表面活性劑，目前己獲得廣泛的研究?；碧侵肿佑捎H水性部分和疏水性部分組成，疏水性部

2、分是飽和或不飽和的十六或十八個碳原子的ω-（或ω-1）羥基脂肪酸，親水性部分是一分子槐糖（葡萄糖-β-1，2-葡萄糖苷），分為內(nèi)酯型和酸型兩大類。本實驗室從環(huán)境中分離出的非致病性擬威克酵母菌株(Wickerhamiella domericqiae Y2A)可產(chǎn)生320 g/L的槐糖脂，具有極大的商業(yè)化應用潛力。因此對槐糖脂深入研究有助于我們得到具有優(yōu)良表面特性的新型槐糖脂，為擴展槐糖脂在日化、食品及醫(yī)藥等眾多領域的應用奠定基礎。

3、　　 本論文主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.對中等碳鏈長度槐糖脂的分離、純化及鑒定。
　　 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加中等碳鏈長度的烷烴（正辛烷、正癸烷、正十二烷和正十四烷）為親脂性底物，同時以只添加葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，采用HPLC-MS的方法分析擬威克酵母所產(chǎn)槐糖脂的種類，并采用GC-MS的方法分析槐糖脂粗品中脂肪酸的碳鏈長度、不飽和度、末端羥基化的程度。以正辛烷為親脂性底物時，采用兩種分析方法均未檢測到中等碳鏈

4、長度槐糖脂及脂肪酸的存在。以正癸烷為親脂性底物時，HPLC-MS分析可檢測到一定量的碳鏈長度為14的酸型槐糖脂的存在。當發(fā)酵培養(yǎng)基中加入正十二烷時，兩種方法均可檢測到較大含量的碳鏈長度為12和14的酸型槐糖脂。以正十四烷為親脂性底物時，可檢測到對應長度的飽和及單不飽和的酸型槐糖脂。四種培養(yǎng)條件下均檢測到正常碳鏈長度的酸型和內(nèi)酯型槐糖脂，未檢測到中等碳鏈長度的內(nèi)酯型槐糖脂的存在。這些結(jié)果表明，通過向培養(yǎng)基中添加碳鏈長度12以上的烷烴，可得

5、到大量碳鏈長度為12和14的酸型槐糖脂。
　　 2.實時熒光定量PCR檢測與脂肪酸碳鏈延長和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析。
　　 分別選取四個與脂肪酸代謝和β氧化相關(guān)的基因和一個線粒體內(nèi)與脂肪酸延長相關(guān)基因，檢測5個基因在以四種中等碳鏈長度的烷烴為親脂性底物合成槐糖脂時的表達差異。與加入正辛烷相比，擬威克酵母在十四烷烴培養(yǎng)條件下，與脂肪酸代謝和β氧化相關(guān)的四個基因的表達量較大;同理，與正癸烷相比，在正十二烷烴培養(yǎng)條件下，與脂肪

6、酸代謝相關(guān)的四個基因的表達量較大。這表明擬威克酵母對較長碳鏈的烷烴的降解幅度較大。
　　 3.編碼脂肪酸合酶α亞基基因的敲除及該基因敲除株（△F）所產(chǎn)槐糖脂組分分析。
　　 依據(jù)基因重組的原理和double-joint PCR的片段融合方法，構(gòu)建了長度為6157 bp的攜帶潮霉素B抗性基因的編碼乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因（ura3）的敲除盒。采用電轉(zhuǎn)化的方法，成功得到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的擬威克酵母菌株。以此菌株為出發(fā)