利用不同底物生產(chǎn)1,3-丙二醇及基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，其中1，3-丙二醇最重要的用途是作為合成新型聚酯材料聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的單體。但目前只有化學(xué)法實(shí)現(xiàn)了1,3-丙二醇工業(yè)化生產(chǎn)。與化學(xué)法相比，微生物法具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境條件友好等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視。迄今為止，自然界中的微生物只能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，由于原料成本較高，與化學(xué)法相比，微生物法制備1，3-丙二醇仍不具有競爭優(yōu)勢。為此，論文圍繞“提

2、高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本”的研究目標(biāo)，分別以Klebsiella pneumoniae，模式菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A和工業(yè)化甘油生產(chǎn)菌株Candida glycerinogenes為研究對(duì)象，采用基因工程、代謝工程和發(fā)酵工程等生物技術(shù)手段開展了應(yīng)用微生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究，取得了以下主要研究成果：
　　 1)為降低K． pneumoniae產(chǎn)1,3-丙二醇過程中由中間產(chǎn)物3-羥

3、基丙醛（3-HPA）累積對(duì)菌體生長和發(fā)酵的不利影響，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat為報(bào)告基因，成功構(gòu)建了K． pneumoniae新型表達(dá)系統(tǒng)pETPkan，并應(yīng)用該表達(dá)系統(tǒng)在K． pneumoniae中過量表達(dá)了1,3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT，構(gòu)建了重組菌K． pneumoniae/pETPkan-dhaT。在發(fā)酵過程中，重組菌3-HPA的最大積累量與原始菌株相比，降低了約3倍，從而有效的促進(jìn)了菌體生長、甘油消耗和產(chǎn)物合成，最終1

4、,3-丙二醇產(chǎn)量為28.9g/L，比野生菌提高了16.5％。
　　 2)考察了搖瓶水平上初始甘油、氮源、無機(jī)鹽等培養(yǎng)條件和pH、溫度、接種量等發(fā)酵工藝條件對(duì)重組菌K．pneumoniae/pETPkan-dhaT甘油轉(zhuǎn)化率和菌體生長的影響，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成：甘油60g/L，酵母膏7g/L，(NH4)2SO40.3g/L，檸檬酸8g/L;優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件：初始pH7.0，培養(yǎng)溫度30℃，裝液量50m

5、L/250mL三角瓶，發(fā)酵接種量(v/v)6％。在優(yōu)化的培養(yǎng)和工藝條件下，重組菌的1，3-丙二醇產(chǎn)量達(dá)到37.7g/L，甘油質(zhì)量轉(zhuǎn)化率提高至62.8％?？疾炝?L發(fā)酵罐上攪拌速度對(duì)1,3-丙二醇分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的影響，在300r/min的條件下，1,3-丙二醇濃度、甘油轉(zhuǎn)化率分別最高達(dá)36.4g/L,60％。7L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵45h后測得1,3-丙二醇產(chǎn)量為62.2g/L。
　　 3)利用C glycerinogene

6、s生產(chǎn)的不同類型的甘油替代重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的純甘油。首先以C. glycerinogenes甘油發(fā)酵液直接作為原料，發(fā)酵結(jié)果顯示，甘油發(fā)酵液中乙醇、乙酸等物質(zhì)影響了菌體的生長和甘油的消耗，發(fā)酵50h1,3-丙二醇產(chǎn)量僅為8.9g/L:在添加NaCl維持高滲條件下，Cglycerinogenes發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度的降低有效減少了乙醇、乙酸的生成，以此發(fā)酵液作為重組菌K． pneumoniae/pETPkan-dhaT發(fā)酵底物，發(fā)酵

7、40h后，1,3-丙二醇產(chǎn)量為24.7g/L;最后選擇工業(yè)級(jí)甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇，測得1.3-丙二醇含量為33.5g/L，甘油質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為55.8％。以工業(yè)級(jí)甘油為原料，K． pneumoniae/pETPkan-dhaT7L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵，1,3-丙二醇產(chǎn)量達(dá)57.8g/L。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明工業(yè)級(jí)甘油可成為替代純甘油發(fā)酵的廉價(jià)原料。
　　 4)首先克隆了K． pneumoniae甘油合成1,3-丙二醇途徑中8.0

8、kb左右大小的dha操縱子，并在大腸桿菌JM109中進(jìn)行了有效表達(dá)，測得甘油脫水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)比酶活分別為1.8U/mg和0.8U/mg，攜帶dha操縱子的大腸桿菌在以甘油為底物發(fā)酵時(shí)，可合成8.6g/L1，3-丙二醇；直接將8.0kbdha操縱子在模式菌株釀酒酵母S．cerevisiae W303-1A中表達(dá)，由于GDHt和PDOR比酶活僅有0.4U/mg和0.3U/mg，最終導(dǎo)致在以葡萄糖為底物

9、的發(fā)酵液中未檢測到1,3-丙二醇；為增強(qiáng)dha基因在S. cerevisiae W303-1A中的表達(dá)，將dhaB和dhaT基因分別置于啟動(dòng)子GAP和轉(zhuǎn)錄終止子AOX1TT之間，利用游離型表達(dá)載體pYX212-zeocin在釀酒酵母中串聯(lián)表達(dá)，測得重組釀酒酵母W303-BT的GDHt和PDOR比酶活分別為15.1U/mg和12.3U/mg;W303-BT直接以葡萄糖為底物發(fā)酵，最終測得1，3-丙二醇產(chǎn)量為1.2g/L。
　　 5

10、)將dha操縱子上的基因片段dha1(dhaT+gdrB)和dha2(dhaB+gdrA)分別置于啟動(dòng)子pGAP和AOX1TT之間，構(gòu)建表達(dá)元件pGAP-dha1-AOX1TT和pGAP-dha2-AOX1TT并串聯(lián)在根癌農(nóng)桿菌雙元載體pCAM3300-zeocin的T-DNA區(qū)域內(nèi)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGAP4。將質(zhì)粒pGAP4電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(ATMT)轉(zhuǎn)化C.glycerinogenes，經(jīng)

11、表型及PCR、Southem Blot驗(yàn)證后將遺傳穩(wěn)定的重組產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-GAP進(jìn)行酶活檢測，測得GDHt和PDOR比酶活分別為1.9U/mg和1.4U/mg，以葡萄糖為底物發(fā)酵，最終測得1，3-丙二醇含量為2.9g/L。
　　 6)將質(zhì)粒pGAP4中的啟動(dòng)子pGAP替換為來源于C．glycerinogenes的鹽壓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pcggpdl，構(gòu)建了質(zhì)粒pGPD4。進(jìn)一步通過ATMT獲得了遺傳穩(wěn)定的重組產(chǎn)甘油假絲酵

12、母WL2002-GPD，測得其GDHt和PDOR比酶活分別為5.1U/mg和3.7U/mg,較WL2002-GAP分別提高約2.7倍和2.6倍；以葡萄糖為底物發(fā)酵測得1,3-丙二醇為6.7g/L，較WL2002-GAP提高約2.3倍。
　　 7)應(yīng)用重組產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-GPD分別在發(fā)酵培養(yǎng)基添加0.5mol/L和1mol/L NaCl的條件下發(fā)酵。結(jié)果表明，與未添加NaCl的發(fā)酵相比，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度的增