腐敗希瓦氏菌卵黃抗體抑菌作用方式的研究.pdf

1、卵黃抗體（IgY），是禽類血清中的IgG進入到卵黃中而形成的一類免疫球蛋白，其性質穩(wěn)定、提取便捷、特異性強、安全高效，作為功能性食品添加劑、食品免疫檢測材料及生物保鮮劑，在食品領域的應用范圍逐漸擴大。腐敗希瓦氏菌卵黃抗體（IgY），是一種靶向性抑制水產品中常見腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的免疫球蛋白，目前研究已證明，腐敗希瓦氏菌IgY在液體、固體培養(yǎng)基中均能抑制腐敗希瓦氏菌體的生長，并能較顯著延長牙鲆魚肉的貨架期。目前，由于腐敗希瓦氏菌IgY

2、的抑菌作用機理尚不明確，在IgY的實際推廣中，存在使用濃度大，作用時間有限等問題，使這種特異性IgY在水產品保鮮中的應用受到了一定的限制，同時在尋求其抑菌增效因子時也存在盲目性。
　　本研究，主要以純度較高的腐敗希瓦氏菌IgY作為研究對象，研究它對抗原菌生長形態(tài)以及各項生理指標的影響，以探究腐敗希瓦氏菌IgY對抑制菌體生長的作用方式，同時對IgY與菌體的作用位點進行了判定。隨后，研究在抑菌作用方式的基礎上，通過蛋白酶酶解的方法對大

3、分子的IgY進行處理，有針對性的尋求一種提高IgY抑菌作用效果的方法。主要的研究結果如下：
　　1.利用凝膠層析的方法，建立了一套有效純化腐敗希瓦氏菌IgY的層析方法，回收率為89.60％，純化后的IgY純度達到92.33%，效價為1:1000以上，相比未經純化的IgY效價提高兩倍以上。
　　2.對腐敗希瓦氏菌IgY對菌體的生長形態(tài)、生理指標進行了觀察和測定，結果發(fā)現(xiàn)經IgY作用后，菌體細胞發(fā)生破裂、扭曲，有些細菌細胞壁明顯

4、變薄。細菌疏水性下降，細胞壁和細胞膜均發(fā)生破裂。菌體與IgY相互作用后的上清溶液，經甘氨酸解離作用后，發(fā)現(xiàn)了一種大分子的特征組分。通過對該特征組分分子量、單糖組成、紅外光譜性質以及脂肪酸成分的測定，并結合核磁信號確定了其大小為58.3萬道爾頓，主要由D-(+)-氨基葡萄糖、D-(+)-氨基半乳糖鹽酸鹽、葡萄糖、D-半乳糖以及古洛糖醛酸構成多糖組分，并含有一定量的十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸，推測為菌體表面脂多糖成分。經過綜合分析，提出I

5、gY抑制腐敗希瓦氏菌生長的方式主要是通過靶向性與菌體表面脂多糖物質發(fā)生類似抗原抗體結合的作用，然后通過靜電等作用，改變菌體疏水性，阻礙脂多糖發(fā)揮保護作用，從而逐漸造成菌體細胞壁松散和細胞膜的破裂，進而造成了菌體的死亡。
　　3.在抑菌作用方式的基礎上，提出保留IgY抗原結合部位，同時適當降低IgY分子量的方法以提高IgY抑菌作用效果。利用高效液相色譜法動態(tài)觀測胃蛋白酶對腐敗希瓦氏菌IgY的作用，確定了胃蛋白酶法制備IgY-Fab的

6、最佳條件為pH=4.2的醋酸緩沖液作用6h，IgY：胃蛋白酶=20:1（質量比）。酶解混合液經Sephacryl S-100 High Resolution柱層析分離純化后，即得43kD的活性片段，純度大于90%。該活性片段保留了大部分的抗原結合和抑菌能力，在對冷藏大菱鲆魚肉的保鮮效果中顯示了優(yōu)于等摩爾濃度IgY的效果。
　　本研究填補了目前卵黃抗體對腐敗希瓦氏菌作用方式的研究空白，有針對性的提出提高IgY抑菌效果的方案，為今后腐