幾種海參巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)解析及構(gòu)效關(guān)系初步研究.pdf

1、海參巖藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)是海參的主要功效成分之一,屬于巖藻聚糖硫酸酯類化合物,具有多種生理調(diào)節(jié)功能,在功能食品的開發(fā)方面展現(xiàn)出良好的應用前景。目前關(guān)于SC-FUC結(jié)構(gòu)研究的報道仍十分稀少,結(jié)構(gòu)信息的匱乏限制了SC-FUC的深入研究及開發(fā)利用?；诖吮尘?本研究解析了三種SC-FUC的結(jié)構(gòu),并進一步結(jié)合其功能研究的結(jié)果,探究了SC-FUC的構(gòu)效關(guān)系。
　　糖苷酶是解析多糖結(jié)構(gòu)的重要工具,但目前尚無商品化的巖藻聚糖硫酸酯酶可

2、供使用。實驗室前期自主篩選得到一株海洋細菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127,并從其胞內(nèi)分離純化得到含巖藻聚糖硫酸酯酶的酶液,命名為CZ1127 FUCase。在此基礎上,本研究首先利用已知結(jié)構(gòu)的美國肉參巖藻聚糖硫酸酯(Ib-FUC)作為底物,研究了該巖藻聚糖硫酸酯酶作用方式。實驗結(jié)果表明該巖藻聚糖硫酸酯酶為內(nèi)切酶;通過解析酶解產(chǎn)物中兩個最小寡糖片段的結(jié)構(gòu),推斷該巖藻聚糖硫酸酯酶主要作用于α-L-Fucp2(OSO3

3、-)-1→3-α-L-Fucp之間的糖苷鍵。后續(xù)實驗將以CZ1127 FUCase為工具解析其他未知結(jié)構(gòu)的SC-FUC。
　　以梅花參(Thelenota ananas)為原料,提取得到梅花參巖藻聚糖硫酸酯(Ta-FUC),其分子量為1284 KDa,硫酸根含量為28.2±3.5％,組成單糖僅為巖藻糖。利用CZ1127 FUCase降解Ta-FUC得到寡糖及低分子量多糖,利用電噴霧電離-碰撞誘導解離-串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-CID-MS

4、/MS)和核磁共振技術(shù)(NMR)解析其結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中都存在重復的四巖藻糖單元α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)。由此推斷, Ta-FUC的結(jié)構(gòu)為[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n。這是一種新型巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)。
　　單

5、純利用CZ1127 FUCase降解海地瓜巖藻聚糖硫酸酯(Am-FUC)制備寡糖的效率較低。針對此情況,首先利用CZ1127胞內(nèi)酶液(含巖藻聚糖硫酸酯酶,硫酸酯酶和巖藻糖苷酶酶活)降解 Am-FUC得到寡糖混合物,通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析混合物中的寡糖組成,并利用SuperdexTM Peptide串聯(lián)定向純化主要寡糖。ESI-CID-MS/MS和 NMR的結(jié)果顯示,四種主要寡糖組分的結(jié)構(gòu)分別為α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,

6、4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(O SO3-)-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1

7、→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fuc p-1→3-α-L-Fucp。利用CZ1127 FUCase降解多糖得到低分子量巖藻聚糖硫酸酯,采用 NMR解析其結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其由四糖重復單元α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)組成。結(jié)合寡糖的結(jié)構(gòu)信息以

8、及 CZ1127 FUCase作用方式,最終推斷 Am-FUC的結(jié)構(gòu)為[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n,這也是一種新型的巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)。
　　通過紅外光譜,NMR和甲基化實驗分析了仿刺參巖藻聚糖硫酸酯(Aj-FUC)的結(jié)構(gòu)信息,發(fā)現(xiàn)其主要由α-L-Fucp2(OSO3-)和α-L-Fucp組成,糖苷鍵主要有α1→

9、3及α1→4兩種類型,支鏈出現(xiàn)在巖藻糖殘基的4位。利用CZ1127 FUCase降解 Aj-FUC得到低分子量多糖 Aj-LMW,通過 NMR解明其結(jié)構(gòu)為[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3(α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→)4-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n。Aj-FUC的結(jié)構(gòu)可能并不完全規(guī)律均一,Aj-LMW的結(jié)構(gòu)約占多糖整體結(jié)構(gòu)的80%以上,因此,可

10、以反映Aj-FUC的主要結(jié)構(gòu)特征。
　　比較研究了Ta-FUC、Aj-FUC、Am-FUC及Ib-FUC四種SC-FUC抗氧化和抑制腫瘤細胞增殖的功能,從而對 SC-FUC的構(gòu)效關(guān)系進行探索。結(jié)果表明:SC-FUC的抗氧化和抑制腫瘤細胞增殖的功能不僅與其硫酸根含量有關(guān),還與硫酸化位點和支鏈取代等精細結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。
　　綜上所述,本文以自主篩選的巖藻聚糖硫酸酯酶為特色工具,制得SC-FUC酶解寡糖。通過ESI-CID-MS