快速特異檢測大腸桿菌0157：H7的B細(xì)胞生物傳感器研究.pdf

1、微生物污染引起的食物中毒是國內(nèi)外食品安全領(lǐng)域中的主要問題，目前急需發(fā)展一個新型、快速、特異和靈敏的檢測食品中致病菌的方法。本課題結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、光學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的最新成果，以大腸桿菌O157∶H7（Escherichiacoli O157∶H7）為模式菌，探討了以B細(xì)胞作為生物傳感器受體元件檢測食源性致病菌的可能性，并研究了兩種基于B細(xì)胞的生物傳感器技術(shù)。
　　1.E.coli O157∶H7和B細(xì)胞的相互作用
　　研

2、究了特異性表達(dá)抗E.coli O157的IgM的B細(xì)胞作為生物傳感器中識別元件的生長特性和IgM的活性。用流式細(xì)胞術(shù)研究B細(xì)胞捕獲不同濃度E.coliO157∶H7的情況，以及B細(xì)胞與E.coli O157∶H7孵育不同時間后的活力。結(jié)果顯示，該B細(xì)胞具有IgM活性，當(dāng)與E.coli O157∶H7孵育1小時，不同濃度細(xì)菌對B細(xì)胞活力均無影響;表明該B細(xì)胞可以作為生物傳感器中的生物識別元件用于構(gòu)建基于細(xì)胞的生物傳感器進(jìn)行食源性大腸桿菌檢

3、測。
　　2.基于化學(xué)鈣離子指示劑B細(xì)胞生物傳感器的構(gòu)建
　　該試驗?zāi)康氖情_發(fā)一個基于化學(xué)鈣離子指示劑的B細(xì)胞生物傳感器。當(dāng)加載了Fura-2的B細(xì)胞與菌體接觸后，B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)介導(dǎo)的鈣離子信號通路被激活，由此導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度在數(shù)秒內(nèi)升高，高濃度鈣離子與Fu ra-2進(jìn)行結(jié)合從而導(dǎo)致其熒光信號的改變以報道靶標(biāo)致病菌的存在。本試驗中的B細(xì)胞生物傳感器在30μL體系中，可以檢測E.col

4、i O157∶H7的菌體數(shù)量低至18個細(xì)胞，檢測范圍為102至105 CFU/mL，檢測時間從樣品準(zhǔn)備到檢測可在10 min左右完成。最后，用該B細(xì)胞生物傳感器對非靶標(biāo)致病菌和食品樣品中的E.coli O157∶H7進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)該傳感器顯示出了優(yōu)良的特異性。
　　3.基于遺傳工程鈣離子指示劑B細(xì)胞生物傳感器的構(gòu)建
　　在該試驗中，使用一個遺傳編碼的鈣離子指示劑(genetically encoded Ca2+indica

5、tors，GECI)作為報告子，構(gòu)建了一個基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET)的B細(xì)胞生物傳感器。當(dāng)E.coli O157∶H7與B細(xì)胞膜表面的IgM結(jié)合時會激活BCR介導(dǎo)的鈣離子信號通路，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時增強，繼而觸發(fā)GECI TN-XXL的FRET發(fā)生以報告致病菌的存在。結(jié)果證實TN-XXL和基于FRET的方法構(gòu)建出的B細(xì)胞生物傳感器用于檢測靶標(biāo)致病菌具