食用植物油外源污染物辣椒素及黃曲霉毒素免疫檢測技術(shù)研究.pdf

1、食用植物油質(zhì)量安全問題不僅影響油料相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，更威脅消費(fèi)者生命安全和消費(fèi)權(quán)益。食品加工和日常烹飪中食用植物油的消費(fèi)量不斷增加，使得大量食用油通過餐廚廢棄油脂的形式流出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大概有1000萬噸的餐廚廢棄油臘產(chǎn)生。正常情況下，這些餐廚廢棄油脂可被作為生物能源加以開發(fā)利用。然而，由于食用植物油種類繁多，價(jià)格差異較大，一些不法之徒受利益驅(qū)使將餐廚廢棄油臘回收后進(jìn)行非法加工，使其再次流向餐桌。食用植物油在經(jīng)過煎炸、水煮等烹飪過程后，

2、其營養(yǎng)價(jià)值大大降低，過氧化值高，反式脂肪酸增多等，還會(huì)因?yàn)榛煊惺澄餁堅(jiān)皠?dòng)物組織等而引起細(xì)菌真菌等污染，導(dǎo)致毒素的產(chǎn)生，例如黃曲霉毒素，作為強(qiáng)致癌物在精煉過程中難以被除去，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者飲食健康。
　　通過對文獻(xiàn)報(bào)道的食用植物油和市場餐廚回收油中辣椒素類物質(zhì)含量的數(shù)據(jù)匯總及分析，發(fā)現(xiàn)辣椒素類物質(zhì)可以作為餐廚回收油的外來標(biāo)志物。針對食用植物油缺乏快速鑒別技術(shù)難題，研究建立了餐廚回收油外來標(biāo)志物辣椒素的免疫親和-超高效液相色譜-多級質(zhì)

3、譜聯(lián)用檢測技術(shù)(IAC-HPLC-MS/MS)和現(xiàn)場免疫快速鑒別技術(shù)，最后再研究建立了食用植物油外源污染物辣椒素類物質(zhì)和黃曲霉毒素同步快速檢測技術(shù)，為保障食用植物油質(zhì)量安全提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。
　　本研究主要內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　1.研究了辣椒素類物質(zhì)半抗原分子設(shè)計(jì)異源學(xué)規(guī)律，探明了辣椒素類物質(zhì)抗原最佳分子結(jié)構(gòu)，成功研制出辣椒素類物質(zhì)高親和力單克隆抗體
　　首次設(shè)計(jì)合成出辣椒素類物質(zhì)4種人工半抗原h(huán)apten X、h

4、aptenA、haptenB和hapten C，將其與蛋白偶聯(lián)后得到人工完全抗原，分別免疫日本大耳白兔得到4種抗血清，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同的抗原結(jié)構(gòu)對免疫效果及免疫分析的影響。利用所合成的免疫效果較好的免疫抗原免疫Balb/c小鼠，選擇效價(jià)與靈敏度均較高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫用于細(xì)胞融合，最后篩選得到1株長勢穩(wěn)定、親和力強(qiáng)、靈敏度高的細(xì)胞株YQQD8，對辣椒素、二氫辣椒素以及合成辣椒素的IC50值分別為8.5、5.0、13.5 ng

5、/mL，說明該細(xì)胞株抗體可以用作辣椒素類物質(zhì)的通用單克隆抗體。
　　2.研究建立了食用植物油辣椒素ELISA批量樣品快速檢測技術(shù)
　　利用辣椒素類物質(zhì)單克隆抗體YQQD8及檢測抗原OVA-hapten C建立了餐廚廢棄油脂中辣椒素類物質(zhì)ELISA檢測方法。辣椒素類物物空白標(biāo)準(zhǔn)曲線、稀釋基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和濃縮基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值依次為5.93 ng/mL、6.64 ng/mL和8.36 ng/mL。該方法能適用于批量食用植物油

6、樣品快速分析。
　　3.研究建立了食用植物油辣椒素?zé)晒馄衩庖叻治黾夹g(shù)
　　設(shè)計(jì)合成出4種辣椒素類物質(zhì)熒光標(biāo)記抗原，選最佳抗原CPC-3-EDF(Rf=0.9)與YQQD8建立辣椒素類物質(zhì)熒光偏振免疫分析技術(shù)(FPIA)，該方法的線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.0126～0.1009μg/mL。與ELISA方法相比，F(xiàn)PIA受基質(zhì)效應(yīng)影響，導(dǎo)致檢測靈敏度略低，但熒光偏振檢測技術(shù)操作更加簡便，加完樣品后即可讀取檢測結(jié)果，避

7、免了人為操作影響。
　　4.研究建立了食用植物油辣椒素類物質(zhì)膠體金免疫層析分析技術(shù)
　　通過將基于辣椒素類物質(zhì)抗體YQQD8的免疫檢測技術(shù)與層析技術(shù)相結(jié)合，研究建立了辣椒素類物質(zhì)膠體金免疫層析分析方法，該方法對辣椒素類物質(zhì)的裸眼可視檢測限為2.00 ng/mL，T線消線濃度為32.00 ng/mL。根據(jù)實(shí)際樣品前處理濃縮，該方法對油脂樣品中辣椒素類物質(zhì)的裸眼可視檢測限為0.40μg/kg，檢測線T線消線濃度為6.5μg/kg

8、。膠體金免疫層析法不僅檢測結(jié)果裸眼可視，且受油脂樣品基質(zhì)影響較小，大大提高檢測靈敏度，可適用于食用植物油樣品快速篩查甄別。
　　5.研究建立了辣椒素類物質(zhì)時(shí)間分辨熒光免疫層析方法(TRFICA)
　　通過將基于辣椒素類物質(zhì)抗體YQQD8的熒光免疫檢測技術(shù)與層析技術(shù)相結(jié)合，研究建立了辣椒素類物質(zhì)時(shí)間分辨熒光免疫層析分析方法(TRFICA)，該方法對檢測辣椒素類物質(zhì)的線性范圍為1.95～62.5 ng/mL。針對油脂樣品提取液濃

9、縮，TRFICA對油脂樣品中辣椒素類物質(zhì)的最低線性檢測范圍是0.39～12.5μg/kg。所建立的TRFICA可以用于油脂樣品中辣椒素類物質(zhì)的定量檢測中，也可以根據(jù)辣椒素類物質(zhì)的含量初步判定所檢的樣品是餐廚廢棄油脂樣品還是疑似花生油樣品。
　　6.研究建立了辣椒素及二氫辣椒素IAC-HPLC-MS/MS確證性檢測方法
　　利用對有機(jī)溶劑耐受較好的辣椒素類物質(zhì)特異性抗體研制免疫親和柱，并將其與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，

10、建立了辣椒素及二氫辣椒素檢測方法IAC-HPLC-MS/MS。該方法對辣椒素及二氫辣椒素的最低檢出限為0.02和0.03μg/kg，定量限為0.08和0.10μg/kg，可以用于檢測油脂中辣椒素類物質(zhì)含量，從而鑒別餐廚廢棄油脂，保障食用植物油質(zhì)量安全。
　　7.研究建立了食用植物油辣椒素和黃曲霉毒素膠體金免疫層析同步分析技術(shù)
　　利用YQQD8與黃曲霉毒素通用抗體1C11首次研制出能夠同步檢測該兩種分析物的膠體金免疫層析試紙