基于定量質(zhì)譜的全局性大腸桿菌新去乙?；竃cgC底物的全局性發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、乙?；且环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,蛋白質(zhì)乙酰化在原核生物和真核生物均廣泛存在。近年來,利用高分辨率質(zhì)譜結(jié)合免疫沉淀技術(shù),已在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了越來越多的乙?；鞍?如在大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)乙?；鞍踪|(zhì)Acs和K609乙?；稽c(diǎn)。與大量的乙?；录鶎?yīng)的是在大腸桿菌中僅有CobB這一個去乙酰化酶。我們實驗室利用Clip-chip技術(shù)結(jié)合大腸桿菌蛋白質(zhì)芯片發(fā)現(xiàn)YcgC是一個新的去乙?；?該酶與CobB差異較大。本研究的目的是進(jìn)行YcgC的全局性

2、底物發(fā)現(xiàn)研究,同CobB進(jìn)行比較,從而進(jìn)一步的對其功能進(jìn)行揭示。
　　本研究利用SILAC技術(shù)整體標(biāo)記蛋白質(zhì),基于高通量質(zhì)譜全局性地發(fā)現(xiàn)CobB和YcgC的底物,并對其底物進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和體外驗證。分別構(gòu)建了YcgC和CobB的過表達(dá)菌株,同時利用Red重組技術(shù)構(gòu)建了YcgC和CobB的敲除菌株。優(yōu)化葡萄糖濃度和YcgC的誘導(dǎo)時間,使YcgC過表達(dá)菌株和野生型菌株整體的乙?；町愖畲蟆２捎眉?xì)胞穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略,13C標(biāo)記賴

3、氨酸,利用泛乙酰化抗體免疫沉淀結(jié)合高分辨率的定量質(zhì)譜,定量找到Y(jié)cgC和CobB的去乙?；孜?。用體外純化的YcgC作用于大腸桿菌蛋白質(zhì)芯片,尋找與YcgC直接相互作用的蛋白?；诙抠|(zhì)譜和蛋白質(zhì)芯片得到的大量的數(shù)據(jù),進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)芯片信號的強(qiáng)弱和歸一化后質(zhì)譜的結(jié)果挑選一系列底物進(jìn)行體外去乙?；磻?yīng)的驗證。YcgC主要底物有7個,分別為rfaQ,trmD,rfbC,narH,frdA,nusB,hisJ,與已報道的CobB的9