有機(jī)磷水解酶納米凝膠生物材料的研制與應(yīng)用.pdf

1、有機(jī)磷水解酶（OPH）是含有雙金屬陽離子活性中心的酰胺水解酶。由于它能夠高效地催化有機(jī)磷類化合物水解，目前已經(jīng)成為有機(jī)磷類殺蟲劑和化學(xué)武器生物解毒材料的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過20多年的發(fā)展，有機(jī)磷水解酶的合成、表征和理論研究已經(jīng)逐漸走向成熟，但原始有機(jī)磷水解酶對環(huán)境變化敏感的特性使得它的實(shí)際應(yīng)用依然停留在起步階段。于是，研究者們開始致力于對這種酶進(jìn)行修飾和穩(wěn)定，以實(shí)現(xiàn)它們在日常生活和生產(chǎn)中的應(yīng)用。
　　本文采用表面丙烯?；妥杂苫酆蠈τ?/p>

2、機(jī)磷水解酶的表面進(jìn)行單分子化學(xué)修飾，得到了同時(shí)具有表面官能性、環(huán)境穩(wěn)定性以及高效催化性的核-殼結(jié)構(gòu)有機(jī)磷水解酶納米凝膠，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷水解酶在細(xì)胞內(nèi)的高效解毒。在此基礎(chǔ)上，以有機(jī)磷水解酶納米凝膠為結(jié)構(gòu)單元，借助旋轉(zhuǎn)涂膜、噴涂或者靜電紡絲等常用加工手段，得到了能夠循環(huán)水解有機(jī)磷化合物的生物催化薄膜和纖維復(fù)合材料。最后以牛血清蛋白為模型分子，通過納米凝膠自組裝制備了具有微-納米多級孔結(jié)構(gòu)的過濾膜。具體研究內(nèi)容和主要結(jié)論如下：
　　1.有

3、機(jī)磷水解酶納米凝膠的制備
　　通過電擊轉(zhuǎn)染的方法成功地從大腸桿菌 BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)了OPH，利用體積排除色譜和離子交換色譜柱分離和提純得到了米氏常數(shù)（Km）和催化活力分別為70 mM和22,320 U/mL的OPH樣品。隨后，通過表面丙烯?；腿芤涸蛔杂苫酆蟽刹椒磻?yīng)合成了OPH納米凝膠。動態(tài)光散射和透射電鏡測試結(jié)果證明：這種以蛋白分子為核、輕度交聯(lián)聚合物為殼的納米凝膠直徑在15 nm左右，且尺度分布均勻。通過改變聚合單體

4、種類和比例，得到了表面分別帶正電和電中性的OPH納米凝膠1和OPH納米凝膠2，并借助Zeta電勢和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對其表面電荷進(jìn)行了表征。
　　2.有機(jī)磷水解酶納米凝膠穩(wěn)定性研究
　　對比了原始OPH、OPH納米凝膠1和OPH納米凝膠2在不同溫度、pH值、有機(jī)溶劑加入量以及生理環(huán)境下的催化活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：在原始OPH完全失活的條件下，OPH納米凝膠依然保持80％以上的催化活力，說明其具有優(yōu)異的溫度穩(wěn)定性

5、；與此同時(shí)，在接近中性溶液以及二甲基亞砜和甲醇存在下，OPH納米凝膠催化活力遠(yuǎn)高于原始OPH，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的pH以及有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。對比不同pH環(huán)境下這三種生物催化劑的催化動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)：殼層聚合物表面化學(xué)修飾并不影響OPH活性中心與底物的親和力（Km不變），同時(shí)也不阻礙底物的擴(kuò)散和產(chǎn)物的離去。此外，由于表面氨基具有質(zhì)子化作用，OPH納米凝膠1對環(huán)境改變有一定的緩沖能力，表現(xiàn)出較高的環(huán)境穩(wěn)定性。
　　3.有機(jī)磷水解酶細(xì)胞內(nèi)解毒效

6、果
　　通過對OPH及其納米凝膠進(jìn)行熒光標(biāo)記，系統(tǒng)地研究了原始 OPH、OPH納米凝膠1以及OPH納米凝膠2分別在貼壁細(xì)胞系（Hela細(xì)胞、Hek293細(xì)胞）和懸浮細(xì)胞系（Jurkat細(xì)胞）中的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝入效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，原始OPH及其納米凝膠都表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡研究結(jié)果表明：原始OP H不能直接進(jìn)入細(xì)胞；OPH納米凝膠2能夠被細(xì)胞攝入，但效率較低；OPH納米凝膠1能夠迅速大量地進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞攝入效

7、率很高。分別采用EEA1抗體和Rab7抗體對Hela細(xì)胞的亞細(xì)胞器早期內(nèi)涵體和初級溶酶體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，跟蹤了Hela細(xì)胞攝入OPH納米凝膠1的過程，發(fā)現(xiàn)OPH納米凝膠1首先吸附在Hela細(xì)胞的細(xì)胞膜上，隨后逐漸穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。具體而言，OPH納米凝膠1通過細(xì)胞內(nèi)吞作用存在于早期內(nèi)涵體中，之后經(jīng)過晚期內(nèi)涵體進(jìn)入到初級溶酶體內(nèi)。
　　4.有機(jī)磷水解酶納米凝膠生物催化復(fù)合材料
　　以O(shè)PH納米凝膠作為結(jié)構(gòu)單元，利用其表

8、面不飽和雙鍵與共聚單體反應(yīng)，借助旋轉(zhuǎn)涂膜或者噴涂裝置，在多種基體材料（玻璃、硅片、云母、碳膜）上制備了均勻的OPH納米凝膠薄膜。此外，利用OPH納米凝膠表面原始蛋白分子所缺少的疏水基團(tuán)，將OPH納米凝膠成功地吸附到靜電紡絲聚苯乙烯和聚丙烯腈纖維表面，得到了具有高催化活力的OPH納米凝膠/聚合物纖維復(fù)合材料。熒光顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果表明，OPH納米凝膠能夠均勻地分散在薄膜內(nèi)或者聚合物纖維表面，沒有發(fā)生明顯的聚集沉淀，因此保持了核心OPH的

9、催化活力。
　　5.模型蛋白納米凝膠多孔膜的制備
　　以牛血清蛋白（BSA）為 OPH的模型蛋白合成了BSA納米凝膠，飛行時(shí)間質(zhì)譜和動態(tài)光散射證明BSA納米凝膠屬于單分子納米凝膠。BSA納米凝膠在溶劑揮發(fā)過程中自組裝形成多孔膜，掃描電鏡、原子力顯微鏡和熒光顯微鏡結(jié)果表明，蛋白納米凝膠自組裝膜具有微-納米多級孔結(jié)構(gòu)。變溫紅外結(jié)果證明，BSA納米凝膠表面酰胺基團(tuán)之間的氫鍵作用力是其自組裝的驅(qū)動力。這種同時(shí)具備納濾膜和生物酶優(yōu)勢的