穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯(lián)物的制備與鑒定.pdf

1、目的：
　　探討應(yīng)用異型雙功能蛋白偶聯(lián)劑衍生物硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)制備穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯(lián)物的可行性，同時(shí)檢測(cè)偶聯(lián)物中的穿膜肽活性、β-葡萄糖苷酶活性及西妥昔單抗活性，為下一步研究其抗腫瘤效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、采用Sulfo-SMCC將氨基水溶性量子點(diǎn)與巰基化穿膜肽進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。將偶聯(lián)后的穿膜肽-量子點(diǎn)和人膀胱癌EJ細(xì)胞

2、共培養(yǎng)，檢測(cè)穿膜肽的活性。
　　2、應(yīng)用硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)將西妥昔單抗、β-葡萄糖苷酶進(jìn)行偶聯(lián)。采用SDS-PAGE、比色法、NHS-Alexa Fluor488標(biāo)記偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定二聯(lián)偶聯(lián)物并檢測(cè)β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗的活性。
　　3、采用同上方法將穿膜肽、β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，制備穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)偶聯(lián)物。采用非還

3、原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定三聯(lián)偶聯(lián)物的連接方式和成份;比色法鑒定三聯(lián)偶聯(lián)物酶活性;采用NHS-Alexa Fluor488對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后將穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)物和EJ細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)三聯(lián)偶聯(lián)物中的穿膜肽活性及抗體活性。
　　結(jié)果：
　　1、穿膜肽活性鑒定結(jié)果:將穿膜肽-量子點(diǎn)與EJ細(xì)胞分別共培養(yǎng)1小時(shí)和2小時(shí)后，在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，

4、人膀胱癌EJ細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光越來(lái)越明顯，而對(duì)照組未見(jiàn)熒光，說(shuō)明穿膜肽具有良好的穿膜活性。
　　2、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的鑒定結(jié)果:SDS-PAGE結(jié)果示在3泳道高分子端可見(jiàn)清晰的條帶，而在β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)條帶。比色法結(jié)果示，等濃度二聯(lián)物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶的酶活性(U/L:669.56±39.23 vs870.60±61.34，t=7.863，P＜0.05)，二聯(lián)物仍然具有良好酶活性。標(biāo)記

5、有綠色熒光的西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶二聯(lián)物與EJ細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)后，置于Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞周圍有綠色熒光，說(shuō)明偶聯(lián)物仍然保持良好的抗體活性;
　　3、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯(lián)物的鑒定結(jié)果:在電泳圖上可見(jiàn)到4泳道高分子端的清晰條帶，而在β-葡萄糖苷酶、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)條帶出現(xiàn)。比色法測(cè)定結(jié)果顯示，等濃度三聯(lián)物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L:612.7

6、5±10.58 vs917.03±22.72，t=21.02，P＜0.05)，但三聯(lián)物仍然保持有一定的酶活性。標(biāo)記有綠色熒光染料的穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)物與EJ細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)后，在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到EJ細(xì)胞內(nèi)與周圍有明顯的綠色熒光，說(shuō)明偶聯(lián)物仍保持良好的穿膜活性與抗體活性。
　　結(jié)論：
　　Sulfo-SMCC可以將穿膜肽、β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗成功的偶聯(lián)在一起，同時(shí)三聯(lián)物仍