離子液體中膠紅酵母苯丙氨酸解氨酶催化性質(zhì)研究.pdf

1、離子液體(Ionic Liquids，IL)，是在室溫或室溫附近(＜100℃)由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成并且呈液態(tài)的鹽類化合物。離子液體具有諸多優(yōu)點(diǎn)，因此受到極大的關(guān)注，被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用到諸多領(lǐng)域，尤其是在生物催化方面被廣泛關(guān)注，目前已經(jīng)被應(yīng)用于木瓜蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等酶催化反應(yīng)中，但在苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化應(yīng)用方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)研究不同離子液體對(duì)PAL催化活性的影響，篩選出能顯著提高PAL活性的離

2、子液體，并進(jìn)一步研究了PAL在該離子液體中各種催化性能。
　　1)膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) PAL的部分純化通過(guò)玻璃珠對(duì)膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)進(jìn)行破壁，提取粗酶液，并在冰浴中利用40％飽和度的硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀，采用透析法除去硫酸銨，進(jìn)而通過(guò)PEG20000對(duì)酶液進(jìn)行濃縮，并通過(guò)Sepharose4B凝膠柱、DEAE-Sepharose FF離子交換柱進(jìn)行了

3、部分純化。結(jié)果表明:PAL純化倍數(shù)為22.71，酶活回收率為35.5％。對(duì)部分純化后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳得到三個(gè)條帶，表明得到部分純化的PAL。
　　2)離子液體的篩選研究了不同濃度的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM]BF4)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]PF6)、1-戊基-3

4、-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PtMIM]BF4)、1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([PtMIM]PF6)、1-已基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([HMIM]BF4)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([HMIM]PF6)8種離子對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phe)生成反式肉桂酸的影響，結(jié)果表明，與單一的緩沖液反應(yīng)體系相比，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)體系中加入55％的疏水性離子液體[HMIM]PF6，酶活性提高了33.5％。
　　3)

5、離子液體[HMIM]PF6對(duì)PAL活性和穩(wěn)定性的影響采用單因素法，研究了PAL在[HMIM]PF6中最適反應(yīng)條件、穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，與單一水相相比，苯丙氨酸解氨酶(PAL)在(水/[HMIM]PF6)兩相中的最適反應(yīng)溫度和pH發(fā)生相對(duì)偏移，分別為40℃和7;溫度耐受性和pH穩(wěn)定性有相對(duì)改善，但變性劑耐受性無(wú)多大改變。在55％[HMIM]PF6反應(yīng)體系中的Km比單一緩沖液體系要低，而且最大反應(yīng)速率vmax也要比單一緩沖體系高。