以CaCO3為模板苯丙氨酸解氨酶的固定化及其催化性能的研究.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是酶法生產(chǎn)L-苯丙氨酸(L-Phe)和治療苯丙酮尿癥的關(guān)鍵酶。但是在實際應(yīng)用過程中，表現(xiàn)出催化效率低、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)使用等問題，嚴(yán)重影響了PAL的使用效率。本研究以碳酸鈣為模板，制備出PAL蛋白顆粒和PAL仿生硅雜化蛋白顆粒，并研究了它們的催化性能。
　　1)不同形態(tài)碳酸鈣模板及其固定化酶的初步制備
　　制備不同形態(tài)的碳酸鈣模板，進行模板優(yōu)化

2、，并將PAL沉淀交聯(lián)固定到碳酸鈣上，用HCl去除碳酸鈣，獲得不同形態(tài)的蛋白顆粒。結(jié)果表明，以球形碳酸鈣為模板的固定化酶形態(tài)規(guī)則、酶活最高。優(yōu)化后的球形碳酸鈣模板制備條件為:在轉(zhuǎn)速為700 rpm下攪拌2h，用乙二醇∶水=3∶1的溶劑配制濃度為0.7 M的鹽溶液，得到的顆粒分布范圍最窄，均勻度最好，比表面積最大。
　　2)苯丙氨酸解氨酶多孔蛋白顆粒的制備及催化性能的研究
　　以球型碳酸鈣為模板，利用共價交聯(lián)法制備了球形多孔蛋白

3、顆粒，對戊二醛濃度和交聯(lián)時間進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳交聯(lián)劑終濃度為0.4％，交聯(lián)時間為1h。在此條件下，成功制備了大小均一的球形蛋白顆粒，該蛋白顆粒最適催化溫度為50℃，最適催化pH為7.0。蛋白顆粒的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、變性劑耐受性、胰蛋白酶耐受性和儲存穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，且蛋白顆粒表現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性。動力學(xué)參數(shù)表明，蛋白顆粒的Vmax低于游離酶，Km高于游離酶，說明蛋白顆粒與底物接觸的傳質(zhì)阻力大于游離酶，與底物親和力低于游離

4、酶。
　　3) PAL仿生硅雜化蛋白顆粒的制備及其催化性能的研究
　　分別制備了包埋有多孔蛋白顆粒的實心球形仿生硅化蛋白顆粒和核殼結(jié)構(gòu)仿生硅化蛋白顆粒，并分別研究了它們的催化性能。核殼結(jié)構(gòu)仿生硅化蛋白顆粒的優(yōu)化制備條件為:將雜化后蛋白顆粒分散在2.2 mL Tris-HCl緩沖液中，十二烷基三甲基溴化銨(CTAB)最佳添加量為300μL，四甲氧基硅烷(TMOS)的最佳添加量為20μL。最終成功制備了兩種仿生硅化蛋白顆粒，實心