維生素C生產(chǎn)菌株的改良及發(fā)酵優(yōu)化的研究.pdf

1、第一部分：轉(zhuǎn)座子是一種基因組上的可移動的遺傳元件，它可以從遺傳物質(zhì)的一部分跳躍到另一部分，從而引起遺傳變異。利用轉(zhuǎn)座子Tn5及其衍生物對原核生物進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變，己廣泛用于基因的鑒定、定位、定向和克隆。Tn5能夠在許多革蘭氏陰性細(xì)菌基因組中進(jìn)行隨機(jī)、單位點(diǎn)的插入，因此可以用Tn5末端序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，或直接進(jìn)行測序等。在本實(shí)驗(yàn)中，通過研究確定了以隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子來更高效的誘變維生素C生產(chǎn)菌株的方法，構(gòu)建了氧化葡萄糖

2、酸桿菌的突變體庫，并采用特定的方法進(jìn)行篩選，獲得了高產(chǎn)菌株并且在10L攪拌式發(fā)酵罐上進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 第一部分 目的：改進(jìn)維生素C生產(chǎn)菌株改良的方法，通過分子生物學(xué)方法對菌種進(jìn)行誘變。高效的獲得突變體庫，建立針對某些性狀的篩選方法。為今后的菌種改良工作奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：首先，通過電轉(zhuǎn)化的方式將具有卡那霉素抗性的Tn5質(zhì)粒隨機(jī)插入維生素C生產(chǎn)菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組中，用抗性平板培養(yǎng)電轉(zhuǎn)后的菌體，挑取單克隆，擴(kuò)

3、增并保種，從而構(gòu)建突變體庫。然后用分子生物學(xué)檢測PCR法確定外源基因是否整合到了宿主的基因組中。通過檢測發(fā)酵過程中果糖的生成量來判斷突變體的副反應(yīng)途徑是否被阻斷。最后，通過發(fā)酵對篩選到的突變株進(jìn)行評價。
　　 結(jié)果：通過實(shí)驗(yàn)證明了維生素生產(chǎn)菌株氧化葡萄糖酸桿菌對卡那霉素的靈敏度，確定篩選培養(yǎng)基的卡那霉素的濃度。確立了采用電轉(zhuǎn)化的方式將Tn5插入氧化葡萄糖酸桿菌的基因組中以及，維生素C生產(chǎn)菌株突變體庫的構(gòu)建方法。確定了PCR檢測的

4、反應(yīng)體系和條件。建立了針對阻斷生成果糖這一副產(chǎn)物反應(yīng)途徑的篩選方法。經(jīng)過500ml搖瓶，2L攪拌式發(fā)酵罐，10L攪拌式發(fā)酵罐等一系列發(fā)酵體系的驗(yàn)證，證明了篩選出的突變體相對原始菌株發(fā)酵收率提升了3％第二部分：自從維生素C二步發(fā)酵法出現(xiàn)后，中國的生產(chǎn)廠家逐漸壟斷了這個品種市場。可見該方法具有很大的優(yōu)勢，但是由于第二步發(fā)酵采用兩種菌株混菌發(fā)酵，其相互作用機(jī)制始終不是十分明晰，為此方法的進(jìn)一步發(fā)展帶來了一定的制約。
　　 第二部分 目

5、的：針對第二步發(fā)酵過程中大小菌的相互關(guān)系，進(jìn)行研究。并對發(fā)酵補(bǔ)料工藝的改進(jìn)進(jìn)行探討。
　　 方法：采用第二步發(fā)酵現(xiàn)有的工藝進(jìn)行發(fā)酵，對過程中的菌體數(shù)量以及各項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行了監(jiān)測，分析數(shù)據(jù)并對兩種菌的關(guān)系進(jìn)行了討論。以小菌濃度作為考察指標(biāo)，按L18(37)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳種子培養(yǎng)基成分配比，并通過發(fā)酵結(jié)果對優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。通過設(shè)計(jì)底物濃度的梯度實(shí)驗(yàn)，研究維生素C二步發(fā)酵過程中的底物抑制現(xiàn)象。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)補(bǔ)料方案，并

6、針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果對流加成分進(jìn)行改進(jìn)。最終采用氣升式15L發(fā)酵罐對流加工藝進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：產(chǎn)酸是與小菌的生長是正相關(guān)的；大菌在發(fā)酵初期生長迅速并產(chǎn)生刺激小菌生長的物質(zhì)但很快被小菌產(chǎn)酸所抑制，隨之小菌生長速率亦逐漸降低。發(fā)酵中后期，大菌在產(chǎn)生芽孢并釋放的過程中可能將胞內(nèi)某些促進(jìn)小菌生長的物質(zhì)釋放出來，造成小菌生長速率的再次升高；大菌生長過程中產(chǎn)生某種刺激小菌生長的物質(zhì)，而小菌產(chǎn)生的古龍酸抑制大菌生長使之始終在數(shù)量上低于小菌。優(yōu)化

7、的培養(yǎng)基配方為玉米漿0.1％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨0，8％，尿素0，1％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.01％。該配方能夠有效提升種子質(zhì)量，并使發(fā)酵周期縮短了16.7％。根據(jù)底物抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了補(bǔ)料方案，針對發(fā)酵過程中有可能存在底物被菌體作為碳源所消耗的現(xiàn)象，設(shè)計(jì)了碳源流加實(shí)驗(yàn)，最終選擇了以木糖作為流加碳源。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)證明利用Tn5的特性，將其運(yùn)用到菌種改良的方法中是可行的，今后可以進(jìn)一步建立一個更加