基于生化策略與組學(xué)技術(shù)的維生素C生產(chǎn)菌株間生理關(guān)系解析.pdf

1、本文以能在胞外大量積累2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的工業(yè)生產(chǎn)菌株酮古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和巨大芽胞桿菌(Bacillus megatermm)組成的混菌體系為研究對(duì)象,在充分理解B.megaterium在維生素C混菌發(fā)酵體系中重要生理作用的基礎(chǔ)上,借助兩菌全基因組測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)解析方法,就混菌發(fā)酵培養(yǎng)中B.megaterium如何促進(jìn)K.vulgare生長(zhǎng)和2-KLG高效合成的生理機(jī)制開(kāi)

2、展研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.采用可定向破壞細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間β-1,4糖苷鍵的溶菌酶以研究混菌發(fā)酵體系中調(diào)控B.megaterium生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)K.vulgare生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響。添加溶菌酶顯著降低了B.megaterium的細(xì)胞存活率,但不影響K.vulgare細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。在B.megaterium對(duì)數(shù)末期(12 h)添加10,000 U/mL溶菌酶導(dǎo)致B.Megaterium迅

3、速裂解快速釋放胞內(nèi)活性物質(zhì),顯著促進(jìn)了K.vulgare生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比,足vulgare最大細(xì)胞濃度和2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了27.4％和28.2％,發(fā)酵周期縮短12h;
　　 2.利用Sanger shotgun法與454高通量基因組測(cè)序(GS FLX Titanium System)相結(jié)合的測(cè)序策略,對(duì)K.vulgate WSH-001進(jìn)行全基因組測(cè)序。K.vulgare WSH-001基因組全長(zhǎng)為3.28 Mb(染

4、色體+質(zhì)粒),包括一條長(zhǎng)度為2,766,400 bp的染色體和長(zhǎng)度分別為267,986 bp和242,715 bp的兩個(gè)質(zhì)粒。進(jìn)化關(guān)系分析表明,K.vulgate WSH-001比其親緣關(guān)系最相近的P.denitrificans PD1222和R.sphaeroides KD131均少了一個(gè)1Mb以上的小染色體,推測(cè)K.vulgare單菌生長(zhǎng)較弱的原因在于其與伴生菌B.Megaterium長(zhǎng)期共存過(guò)程中進(jìn)行了基因組縮減,丟掉了其單獨(dú)生長(zhǎng)

5、所必需的部分基因,導(dǎo)致其DNA復(fù)制系統(tǒng)、氨基酸代謝系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)、輔因子代謝系統(tǒng)等大量相關(guān)基因在基因組中未找到?；蚪M信息顯示,K.vulgare WSH-001基因組中含有從D-山梨醇到2-KLG轉(zhuǎn)化所需要的全部蛋白所需的基因;
　　 3.混菌培養(yǎng)過(guò)程中,K.vulgare細(xì)胞生長(zhǎng)和2-KLG合成強(qiáng)烈依賴(lài)于B.megaterium。對(duì)B.megaterium WSH-002進(jìn)行全基因組測(cè)序,得到由一條長(zhǎng)度為4,047,91

6、2 bp的染色體和長(zhǎng)度分別為74,613 bp、9,699 bp和7,006 bp的三個(gè)質(zhì)粒組成的全長(zhǎng)4.14 Mb基因組。對(duì)基因組進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn),除了DNA修復(fù)系統(tǒng)中未發(fā)現(xiàn)編碼DNA聚合酶Ⅲ中θ、X、ψ亞基的基因和Dam甲基化酶編碼基因外,B.megatermm WSH-002的其他代謝途徑基本完整:B.megaterium WSH-002與已經(jīng)測(cè)序的B.megaterlum QMB1551的親緣關(guān)系最近,兩者的16S rDNA序列的相

7、似性為100％,核酸序列的相似性為95-97％。從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看,B.megaterium WStt-002與B.cereus組群親緣關(guān)系較近,有40％的保守基因;
　　 4.為了闡明B.megaterium對(duì)K.vulgare的伴生機(jī)制,研究了產(chǎn)酸穩(wěn)定期K.vulgare在B.megatertum伴生與否時(shí)胞內(nèi)蛋白表達(dá)差異情況。對(duì)質(zhì)譜鑒定得到的419種蛋白點(diǎn)進(jìn)行COG注釋發(fā)現(xiàn):(1)約有20％蛋白點(diǎn)與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān);(2)與

8、蛋白質(zhì)翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)、生物合成、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白占總鑒定蛋白的10.5％和8.6％。當(dāng)B.megaterium和K.vulgare共同培養(yǎng)時(shí),K.vulgare胞內(nèi)總蛋白點(diǎn)(已表達(dá))比K.vulgare單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)增加了約30％。進(jìn)一步進(jìn)行差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),151種蛋白在B.megaterium伴生時(shí)表達(dá)量顯著升高,其中氨基酸代謝、蛋白質(zhì)翻譯、能量代謝等相關(guān)蛋白約占41％。此外,B.megaterum還明顯促進(jìn)了K.vulga

9、re的輔因子代謝、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成等:
　　 5.為了獲得一種K.vulgare和B.megaterium生長(zhǎng)和高效產(chǎn)酸的全合成培養(yǎng)基,以滿(mǎn)足兩菌基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與驗(yàn)證和定量模擬的需求。作者詳盡分析了18批次玉米漿組分(約為40種,其中17種為氨基酸、9種為維生素和14種為金屬元素)的含量,其中氨基酸約占30％,金屬元素占10％左右,此外還含有8種水溶性維生素。玉米漿組分濃度變化高度線性關(guān)聯(lián)2-KLG發(fā)酵參數(shù)的變化:絲氨

10、酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、煙酸和生物素這6種組分對(duì)2-KLG生產(chǎn)效率產(chǎn)生顯著影響?；谏鲜龆繙y(cè)定與定性分析,結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)得到影響2-KLG生產(chǎn)效率的關(guān)鍵玉米漿組分的最佳組合為:絲氨酸0.28 g/L、甘氨酸0.36 g/L、蘇氨酸0.18 g/L、脯氨酸0.56 g/L、煙酸0.19 g/L、生物素0.62 mg/L。采用這一最佳營(yíng)養(yǎng)組合,經(jīng)28 h培養(yǎng),K.vulgare最大細(xì)胞濃度、2-KLG產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到4.1