中溫α-淀粉酶編碼基因劑量對其生產(chǎn)水平提升的重要作用.pdf

1、中溫α-淀粉酶是重要的工業(yè)酶制劑之一，廣泛用于淀粉糖生產(chǎn)、味精生產(chǎn)、啤酒和酒精生產(chǎn)中輔料的加工、織物退漿、以及其它釀造、有機(jī)酸和醫(yī)藥行業(yè)。目前，國內(nèi)主要的工業(yè)生產(chǎn)菌株為BF-7658和Bacillus sp.M13。近20年來，我國學(xué)者一直未對中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株進(jìn)行有效的遺傳改良，使得其發(fā)酵生成水平落后于世界先進(jìn)水平。因此，通過現(xiàn)代育種技術(shù)對中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改良，將有助于提升我國中溫α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平，實(shí)現(xiàn)其

2、高效低成本制備。
　　 本課題以中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株B.amyloliquefaciens CICIM B2125為研究對象，純化了該菌株產(chǎn)生的中溫α-淀粉酶并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究；克隆了中溫α-淀粉酶全長基因并驗(yàn)證了該基因的功能；對中溫α-淀粉酶基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，改變了中溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)；建立了中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法，并通過提高中溫α-淀粉酶基因拷貝數(shù)顯著增強(qiáng)了α-淀粉酶的分泌。
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3、.純化了B.amyloliquefaciens CICIM2125產(chǎn)生的α-淀粉酶(BAA)并首次確定了純酶的酶學(xué)性質(zhì)。通過純化，從發(fā)酵液中獲得了電泳純的BAA。酶回收率為20.1％，純化倍數(shù)為26.9。對純化的BAA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定，該酶的分子量為58 kDa，最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為6.0-9.0。pH穩(wěn)定范圍為7.0-10.0。添加10 mmoL/L Ca2+，可以使酶在55℃下保溫1 h，還殘留85％左右的活力。

4、無Ca2+情況下，該酶在55℃下保溫15 min，喪失活力。Ca2+，Mn2+，Co2+可以顯著增強(qiáng)酶的活力。薄層層析分析表明：酶的淀粉水解產(chǎn)物主要為糊精和一些寡糖。
　　 2.克隆了BAA全長編碼基因amyQ。該基因由啟動(dòng)子區(qū)(220 bp)，結(jié)構(gòu)基因(1544 bp)及終止序列(320 bp)構(gòu)成。在啟動(dòng)子區(qū)有3個(gè)堿基序列發(fā)生了突變，分別位于-49位的堿基發(fā)生改變(C→T)，-79和-80位的堿基由(TA→AT)，結(jié)構(gòu)基因與

5、已報(bào)到的BAA編碼基因(GenBank登錄號(hào)：J01542)一致。
　　 3.克隆的amyQ基因在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中獲得活性表達(dá)。將無信號(hào)肽的BAA結(jié)構(gòu)基因(amyQ)克隆入表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建了重組載體pET-28a-amyQ'，通過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中表達(dá)，重組菌的α-淀粉酶活力為2.8 U/mL培養(yǎng)液。重組酶的相對分子量為58 kDa。將攜帶有全長基因amyQ的重組載體pLY-amyQ，轉(zhuǎn)化B.subt

6、ilis lA510后，實(shí)現(xiàn)amyQ的分泌表達(dá)，所表達(dá)的重組BAA經(jīng)純化后，分析其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其與天然BAA在酶學(xué)性質(zhì)上沒有明顯差異。
　　 4.進(jìn)一步選取了BAA中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)上的3個(gè)氨基酸殘基(231，233，438)進(jìn)行定點(diǎn)突變，對突變體的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較。與天然BAA相比，突變體D233N的比酶活下降了的84.8％；Km上升了55.6％，Kcat值下降了85％；熱穩(wěn)定性明顯下降，最適反應(yīng)溫度范圍也減小了10℃；最適

7、反應(yīng)pH下降了0.5個(gè)單位，pH穩(wěn)定范圍下降了3-4個(gè)單位。與對照相比，突變體D231N和D438G的比酶活分別下降了6.3％和3.5％，Km和Kcat值與對照相比沒有顯著變化；最適反應(yīng)溫度，熱穩(wěn)定性及最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性變化不顯著。
　　 5.成功構(gòu)建了重組BAA工業(yè)生產(chǎn)菌株，產(chǎn)酶水平顯著提升。建立了BAA生產(chǎn)菌株優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)4.8×102。將pLY-amyQ轉(zhuǎn)化B.amyloliquefaciens C