重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的流加策略及工業(yè)化放大.pdf

1、堿性果膠酶(PGL)是指一類在堿性環(huán)境中仍然具有較高活性的果膠酶。堿性果膠酶可作為一種天然助劑應用于紡織品,纖維制品等的精煉處理工藝中,對作物表面的纖維質(zhì)和果膠質(zhì)等雜質(zhì)有一定的去除效果,同時對纖維素的損傷效果也不如堿法明顯。因此,若將以堿性果膠酶為主的生物酶精練工藝替代傳統(tǒng)的高溫高堿的化學工藝,不僅可減少環(huán)境污染嚴重和能耗較高等問題,而且可提高棉織物和紡織品的質(zhì)地。
　　 本課題在前期的研究中已經(jīng)取得一定的成果:從自然環(huán)境中分離

2、篩選得到了一株高產(chǎn)堿性果膠酶的枯草芽胞桿菌Bacillus sp.WSHB04-02。之后利用分子克隆技術,將PGL的基因成功地表達于畢赤酵母GS115中;隨后又通過高密度發(fā)酵和低溫誘導發(fā)酵等策略,使PGL的產(chǎn)量有了大幅度的提高。在此基礎上,本論文通過詳盡分析了在菌體誘導期,利用混合碳源流加對重組Pichia.pastoris GS115高效表達的影響,發(fā)現(xiàn)山梨醇與甲醇的混合添加對PGL產(chǎn)量的提高作用較為明顯;通過對細胞死亡率,胞內(nèi)醇氧

3、化酶和蛋白酶降解作用等研究進一步分析了山梨醇在提高PGL的產(chǎn)量時所起的作用。在此基礎上,本研究又完成了堿性果膠酶發(fā)酵生產(chǎn)的初步放大和中試研究,即從3 L,30 L,1000 L,到5000 L的逐級放大過程。主要研究結果如下:
　　 1為提高重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶(PGL)的產(chǎn)量和生產(chǎn)強度,在誘導期采用多種碳源與甲醇混合添加的模式。實驗結果發(fā)現(xiàn):甘油、山梨醇、乳酸與甲醇的混合添加均可以提高PGL的產(chǎn)量,其中山梨醇與甲醇的混合

4、流加效果最為顯著。研究表明,當以一個合適的流速添加山梨醇,甘油和乳酸等碳源時,堿性果膠酶的產(chǎn)量可以明顯得到提高。而由于胞內(nèi)啟動子并沒有被抑制,即其對應的醇氧化酶的活力沒有被削弱,進而使畢赤酵母表達外源蛋白效率提高,且山梨醇對堿性果膠酶產(chǎn)量的提高較為明顯。當山梨醇的流速為3.6g(H·L)時,PGL酶活可達1593 U/mL,生產(chǎn)強度為16.7 U/(mL·h),比對照分別提高了84.6％和45.2％,實現(xiàn)了堿性果膠酶的高效生產(chǎn)。

5、　　 2在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了山梨醇和甲醇混合添加的方式可以顯著提高PGL的產(chǎn)量,當山梨醇的流速為3.6 g/(h·L)時,PGL酶活可達1593 U/mL。為了從機理上研究PGL產(chǎn)量提高的原因,本實驗主要考察了以下幾個參數(shù)指標的變化:首先山梨醇的添加顯著降低了細胞死亡率,在誘導90 h以后,細胞死亡率從25％降低為9％左右;其次,3.6 g/(h·L)的山梨醇流速不但不會抑制啟動子的表達,甚至有一定的促進作用,胞內(nèi)醇氧化酶AOX的酶活

6、為6.9 U/g(對照為5.7 U/g);第三,由于細胞死亡率的降低,一定程度上削弱了由于細胞死亡而向胞外釋放蛋白酶的過程,進而降低了蛋白酶對PGL的分解作用。所以我們認為在畢赤酵母表達體系中,山梨醇和甲醇的混合流加對于提高外源蛋白的產(chǎn)量有著明顯的促進作用。
　　 3為實現(xiàn)堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn),進行了不同反應器規(guī)模的放大研究,完成了從3L、30 L、1000 L至5000 L發(fā)酵罐的逐級放大。在克服了溶氧,傳質(zhì)等限制性問題以后