南極磷蝦精氨酸激酶分離純化系統(tǒng)建立與變性條件分析.pdf

1、精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)廣泛存在于無脊椎動物如昆蟲、蝦、蟹及軟體動物中,是一種與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶。本論文對南極磷蝦肌肉中的精氨酸激酶進(jìn)行了分離純化,并進(jìn)行了變性研究。包括開展常用變性劑 SDS、鹽酸胍和尿素對精氨酸激酶活力和構(gòu)象的影響研究,旨在獲得南極磷蝦精氨酸激酶(ESAK)的活性、結(jié)構(gòu)和去折疊機(jī)制的相關(guān)信息,為從抑制AK的方向篩選治療寄生蟲疾病藥物提供參考。另外,本論

2、文還對ESAK進(jìn)行了熱變性研究,通過溫度對酶活及熒光的影響來分析導(dǎo)致熱變性聚沉的原因,并用不同的滲透劑研究對熱變性的減緩作用。本研究為進(jìn)一步探討精氨酸激酶在南極蝦能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)中的機(jī)理,從而為南極磷蝦捕撈后延長待加工期間的保鮮期奠定理論基礎(chǔ)。同時也為后續(xù)其他物種精氨酸激酶的性質(zhì)和功能研究提供參考,本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:
　　1. ESAK的分離純化系統(tǒng)建立
　　由于南極磷蝦原料的特殊性,本論文對文獻(xiàn)中的AK提取方法進(jìn)行了改

3、進(jìn)。南極磷蝦勻漿液經(jīng)硫酸銨分級沉淀處理,離心獲得的粗酶液經(jīng)Sephacryl S-200凝膠過濾層析,Blue Sepharose親和層析,最后透析除鹽處理后獲得了純的精氨酸激酶。其比活力為1672.31unit/ mg,總純化倍數(shù)為4.67,酶活回收率為28.9％。SDS-PAGE凝膠電泳顯示單一的、分子量為40KD左右的帶,純化效果比較理想。
　　2. ESAK的酶學(xué)性質(zhì)研究
　　ESAK的動力學(xué)參數(shù)為 KmATP=0.

4、467±0.113 mM,KmArg=0.295±0.053 mM, Vmax=207.9±39.5 mM·min-1。與河蜆,牡蠣,蝗蟲相比顯示出極高的活性。ESAK不耐高溫,pH對它的活性影響較大,最適溫度是30℃,最適pH為8.0。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光發(fā)射光譜表明當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時,內(nèi)源熒光光譜,在333.8nm處有最大吸收峰,表明色氨酸深埋于蛋白質(zhì)當(dāng)中,而不是存在于蛋白質(zhì)表面。
　　3. ESAK變性條件分析
　　

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濃度為1.0 mM的SDS,1.0 M的鹽酸胍和8.25 M的尿素中, ESAK完全失活。通過失活時間過程的測量,顯示在一定濃度范圍內(nèi),失活速率是濃度依賴性的,失活過程出現(xiàn)了單相到雙相失活過程即快相、慢相的變化,為一級反應(yīng)動力學(xué)過程。在構(gòu)象變化方面,ESAK以不同的方式去折疊:SDS是通過增加疏水性來改變,但保留結(jié)構(gòu)構(gòu)象,鹽酸胍和尿素則是誘導(dǎo) ESAK的構(gòu)象結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化并且引發(fā)動力學(xué)去折疊機(jī)制。
　　4. ES