超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于蛋雞血漿中利巴韋林代謝規(guī)律研究.pdf

1、我國(guó)是禽產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)，禽產(chǎn)品質(zhì)量安全時(shí)常面臨獸藥殘留、病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。在“速生雞”事件中，養(yǎng)殖戶違規(guī)使用金剛烷胺、利巴韋林等人用抗病毒藥物，引起消費(fèi)者極大關(guān)注，同時(shí)也暴露出獸藥殘留對(duì)禽產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響。由于利巴韋林在雞體內(nèi)的相關(guān)基礎(chǔ)性研究尚屬空白，面對(duì)違禁使用的客觀事實(shí)，尚不能對(duì)此實(shí)施有效的監(jiān)管。本研究以蛋雞為研究對(duì)象，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法檢測(cè)血漿中的利巴韋林及主要代謝產(chǎn)物1H-1，2，4-三

2、氮-3-甲酰胺(TCONH2)、1-β-D-呋喃基核糖-三氮唑-3-羧酸(RTCOOH)，并對(duì)利巴韋林在蛋雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)利巴韋林在肝微粒體體內(nèi)代謝進(jìn)行初步探索。
　　1.蛋雞血漿中利巴韋林及主要代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法的建立
　　建立了同時(shí)檢測(cè)血漿中利巴韋林及其主要代謝物TCONH2和RTCOOH的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。以13C5-利巴韋林為內(nèi)標(biāo)，雞血漿樣品加入適量甲醇沉淀蛋白，前處理樣品經(jīng)ZORB

3、AX SB-Aq(3.0 mm×100mm，1.8μm)色譜柱分離，以0.1％甲酸水和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果表明:利巴韋林、TCONH2、RTCOOH線性范圍分別為5～5000ng/mL、5～5000ng/mL、50～5000ng/mL，相關(guān)系數(shù)r2分別為0.9947、0.9992、0.9976。高、中、低三個(gè)濃度(1000、100、10 ng/mL)質(zhì)控樣品的添加回收率，

4、均在84.1％～108.2％之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.6％～13.4％(n=6)，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8％～16.9％(n=12)。利巴韋林、TCONH2、RTCOOH在血漿樣品中的的檢出限分別為2、2、10ng/mL，定量限為5、5、20 ng/mL。該方法快速省時(shí)，有效地排除了內(nèi)源性干擾，分離了利巴韋林、TCONH2、RTCOOH，并采用MRM模式測(cè)定，定性準(zhǔn)確。本方法線性范圍寬，重復(fù)性好，適用于血漿樣品中利巴韋林及主要代謝產(chǎn)物的測(cè)

5、定。
　　2.利巴韋林在蛋雞體內(nèi)代謝規(guī)律初步研究
　　京紅蛋雞單劑量口服灌喂利巴韋林30mg/kg BW，采集給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的靜脈血，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血漿中利巴韋林濃度。結(jié)果顯示，給藥后血漿中利巴韋林濃度迅速升高，隨著代謝消除的進(jìn)行，血藥濃度逐漸下降，24h時(shí)血藥濃度低于方法檢出限。采用非房室藥動(dòng)力學(xué)軟件WinNonlin6.3對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):藥時(shí)曲線下面積(AUC0-t)

6、、血漿消除半衰期(T1/2β)、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、達(dá)峰濃度(Cmax)分別為（10658.18±2627.348）h·ng/mL、(2.9461±0.9010)h、(1.5909±0.7355)h、(2796.54±1120)ng/mL。數(shù)據(jù)表明，蛋雞口服給藥利巴韋林后吸收迅速，到達(dá)峰值時(shí)間短，體內(nèi)分布廣，消除速度快。
　　TCONH2和RTCOOH在蛋雞血漿中的濃度隨著原藥的吸收代謝，呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，24h后均低于檢出

7、限，呈現(xiàn)出穩(wěn)定的生成和消除過(guò)程。利巴韋林在血漿中的代謝產(chǎn)物以RTCOOH為主，約占70％，且RTCOOH在兩種代謝物中所占比例隨時(shí)間進(jìn)行呈緩慢下降趨勢(shì)，最終穩(wěn)定在75％。
　　3.利巴韋林在雞肝微粒體中體外模擬代謝研究
　　采集空白蛋雞肝臟組織，并用差速離心法制備肝微粒體，研究肝微粒體蛋白濃度、體外孵育時(shí)間和孵育條件對(duì)利巴韋林代謝消除的影響，并采用線性離子阱質(zhì)譜對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，利巴韋林不與肝微粒體反應(yīng)，孵育樣品