全細胞脂肪酶生物催化劑的構(gòu)建及其在生物轉(zhuǎn)化中的應用.pdf

1、綠色化工的興起為高效率、低能耗、低排放生產(chǎn)化工產(chǎn)品提供了充分保障。生物轉(zhuǎn)化是綠色化工的重要組成部分，脂肪酶由于其催化反應及底物類型多樣而在生物轉(zhuǎn)化中扮演了重要角色。目前應用的脂肪酶主要是游離型脂肪酶或基質(zhì)固定化脂肪酶。近年來，全細胞生物催化劑做為降低酶催化劑成本的最有前景的方法之一，引起研究工作者的重視。酵母展示表達系統(tǒng)構(gòu)建的全細胞脂肪酶生物催化劑由于使酶分子成為細胞壁的一部分并且展示在細胞表面，故不僅在活性和穩(wěn)定性方面顯著高于游離酶和

2、基質(zhì)固定化酶，且大大降低了生產(chǎn)成本，可多次重復利用，為脂肪酶的高效生物轉(zhuǎn)化研究及應用提供了有效的途徑。
　　 本論文根據(jù)酵母密碼子偏愛性優(yōu)化設(shè)計脂肪酶ROL和CALB兩個基因，利用釀酒酵母和畢赤酵母表面展示表達系統(tǒng)，用連接肽將脂肪酶與酵母細胞壁成分α凝集素連接，成功構(gòu)建了4個重組酵母全細胞脂肪酶生物催化劑。以釀酒酵母表面展示表達ROL的全細胞脂肪酶生物催化劑為例，研究其酶學性質(zhì)、水相油脂水解應用、非水相生物柴油合成應用及分子印跡

3、法的影響等方面展開研究工作，并得出以下主要結(jié)論：
　　 1，三丁酸甘油酯平板水解圈法鑒定陽性克隆及液體培養(yǎng)基發(fā)酵上清液測定無脂肪酶活性，證明了釀酒酵母表面展示表達ROL的全細胞脂肪酶生物催化劑構(gòu)建成功。據(jù)我們所知，這是首次報道α凝集素釀酒酵母展示表達系統(tǒng)與密碼子優(yōu)化技術(shù)結(jié)合，從而獲得了高酶活的全細胞脂肪酶生物催化劑。其水解酶活為25±0.89 U/g干細胞，最適溫度40℃，最適pH7.0，酯化酶活為5.12 U/g干細胞。

4、>　　 2，以水解三丁酸甘油酯為例，研究了全細胞脂肪酶生物催化劑的水解應用。證實全細胞脂肪酶生物催化劑在水相中有很強的水解能力，144小時丁酸的轉(zhuǎn)化率達到96.91％。未來將可以嘗試應用于各種有酯鍵結(jié)構(gòu)的底物水解。
　　 3，首次報道將分子印跡技術(shù)和全細胞脂肪酶生物催化劑結(jié)合，顯著提高了全細胞脂肪酶生物催化劑在有機相中的催化活性和熱穩(wěn)定性。在有機相油酸甲酯的生物轉(zhuǎn)化反應中，分子印跡法制備的全細胞脂肪酶生物催化劑轉(zhuǎn)化率為96.3

5、0%，是非分子印跡組的2倍(50.32%)。分子印跡技術(shù)使脂肪酶的催化活性中心在有機相中保持活化狀態(tài)，極大提高了催化效率。而在水相中，分子印跡法制備全細胞脂肪酶生物催化劑對其水解活性和熱穩(wěn)定性提高不顯著。
　　 4，分子印跡法制備的全細胞脂肪酶生物催化劑成功應用于生物柴油的生物轉(zhuǎn)化試驗，在有機相中大豆油轉(zhuǎn)化成生物柴油，轉(zhuǎn)化率為77.71%，是非分子印跡組的5倍(15.46%)。進一步證明了分子印跡技術(shù)在有機相中可顯著提高全細胞脂