肥胖患者及非酒精性脂肪性肝病患者基因表達調(diào)控機制初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代化進程的加快，人民生活水平快速提高、飲食習慣發(fā)生了很大的改變，長期的能量攝入與消耗不平衡，使人體內(nèi)的脂肪組織大量增加，即被定義為肥胖。在超過三十年的時間里，肥胖成為全球性的健康問題。在已知研究中，發(fā)現(xiàn)肥胖與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關，其中以肝臟疾病、Ⅱ型糖尿病、心腦血管疾病及某些特定癌癥為代表。而飲酒人數(shù)劇增以及受到的藥物影響等因素，加上預防醫(yī)療措施相對滯后，被稱為現(xiàn)代“富貴病”的脂肪性肝病發(fā)病率在我國呈逐年增高。據(jù)統(tǒng)計，目前脂肪性

2、肝病發(fā)病率較5年前增加了50倍，而且有年齡向低齡化發(fā)生的趨勢。尤其是一些經(jīng)濟較發(fā)達地區(qū)，脂肪性肝病已成為一種常見疾病。流行病學調(diào)查顯示:脂肪性肝病的發(fā)病率已占到平均人口的10％，在肥胖、嗜酒和糖尿病人群中可高達50％～60％，不少醫(yī)院甚至查出十四五歲的小脂肪性肝病患者。脂肪性肝病按照病因一般分為兩大類，酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病，尤其是非酒精性脂肪性肝病除了與酒精性脂肪性肝病一樣可導致肝病相關殘疾和死亡外，還與Ⅱ型糖尿病、代謝

3、綜合征及其相關心腦血管病事件有著密切的關系。因此，脂肪性肝病已成為當代肝病領域的新挑戰(zhàn)，對人類健康和社會造成了巨大的威脅。大量研究已經(jīng)證實，非酒精性脂肪性肝病與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、高血脂代謝綜合征等機體代謝紊亂的疾病以及心血管疾病密切相關，若這些疾病沒有得到有效的控制或治療，將會伴隨NAFLD的發(fā)生，且疾病之間相互作用滲透，形成惡性的循環(huán)。
　　80年代未隨著人類基因組計劃的啟動，隨著現(xiàn)代生物學與醫(yī)學科學和生物統(tǒng)計學、信息科

4、學、計算機科學、數(shù)學等學科相互滲透并高度交叉形成的一門新興前沿學科——生物信息學。隨著基因組測序數(shù)據(jù)迅猛增加，特別是人類基因組計劃的順利推進，產(chǎn)生了海量的生物學數(shù)據(jù)，生物分子數(shù)據(jù)的積累速度呈指數(shù)增加。這些數(shù)據(jù)隱藏著豐富的生物學知識，具有豐富的內(nèi)涵。充分利用這些數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)處理、分析，揭示這些數(shù)據(jù)的內(nèi)在含義，得到對人類有用的信息，是生物學家和數(shù)學家所面臨的嚴峻的挑戰(zhàn)。生物信息學正是為迎接這種挑戰(zhàn)而發(fā)展起來的一個交叉學科。
　　本研

5、究利用生物信息學技術，對公開發(fā)表的肥胖患者數(shù)據(jù)集GDS3602和非酒精性脂肪性肝病數(shù)據(jù)集GSE49541的早期階段(mild)和晚期階段(advanced)的全基因組表達數(shù)據(jù)進行挖掘，利用Qlucore Omics Explorer、BRB-ArrayTools、PANTHER及DAVID進行生物信息學分析。本研究利用Qlucore Omics Explorer及DAVID在線分析工具對數(shù)據(jù)集GDS3602進行分析，并結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用

6、網(wǎng)絡分析肥胖的發(fā)生機制。同時用BRB-ArrayTools軟件及DAVID在線分析工具等對肝纖維化程度不同的mild和advanced非酒精性脂肪性肝病患者進行比較，篩選他們之間的差異表達基因。結(jié)果顯示，兩個階段基因表達差異明顯，說明在出現(xiàn)非酒精性肝硬化前，重度的肝纖維化患者基因表達已發(fā)生了較大變化，提示非酒精性脂肪性肝病轉(zhuǎn)化為肝硬化這個過程中，重度肝纖維化是一個較為重要的階段。我們利用差異基因構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

7、。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)通過與核酸、小分子或者其他蛋白質(zhì)進行相互作用來執(zhí)行各種生物功能，蛋白質(zhì)間的相互作用存在于每個細胞的生命過程中，是生命活動過程的基礎。因此，繪制蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡圖譜，將會幫助我們了解許多生命活動的機制。網(wǎng)絡中每個節(jié)點對于整個網(wǎng)絡的影響可以用不同的參數(shù)來描述，通過對于網(wǎng)絡的計算，選取合適的條件，我們可以得到對于蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡較為重要的網(wǎng)絡節(jié)點，這些節(jié)點的存在對于整個網(wǎng)絡的穩(wěn)定性至關重要，所以這些核心節(jié)點在疾病的發(fā)展過

8、程中處于重要位置，對于這些節(jié)點可以作為潛在的治療靶點，經(jīng)過對獲得的上調(diào)蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡和下調(diào)蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡的分析計算，分別獲得了10個核心節(jié)點，和17個核心節(jié)點。我們將這些核心節(jié)點分別與上調(diào)表達差異基因和下調(diào)表達差異基因進行映射，于是共獲得了12個重合的基因，CYP3A4、EFHD1、GALK1、GCDH、GSTZ1、MT1X、SORL1、CACNA2D1、EPHA3、GINS1、GINS2和GJA這12個核心節(jié)點的表達量發(fā)生了變化，說明

9、這12個基因?qū)τ诜蔷凭灾拘愿尾〉陌l(fā)生發(fā)展起著至關重要的作用。于是我們在收集的臨床標本中驗證它們的表達量。
　　對獲得的12個核心節(jié)點基因原始表達量進行統(tǒng)計學分析，保留具有統(tǒng)計學意義的基因。其中EFHD1(P=0.001)、GALK1(P=0.001)、GCDH、(P=0.004)和MT1X(P=0.01)的mRNA表達量在早期非酒精性脂肪性肝病中顯著升高，CACNA2D1(P=0.002)、EPHA3(P=0.003)、GIN

10、S1(P=0.001)和GJA1(P=0.01)的mRNA表達量在晚期非酒精性脂肪性肝病中顯著升高，構(gòu)建ROC(receiveroperating characteristic)曲線用以預測早晚期非酒精性脂肪性肝病核心蛋白mRNA表達水平。qPCR結(jié)果表明8核心節(jié)點基因的在早晚期非酒精性脂肪性肝病中表達顯著不同，特別是EFHD1、GALK1、GCDH、CACNA2D1、 MT1X、EPHA3、GINS1、GJA1，可能在非酒精性脂肪肝進

11、展的生物過程扮演了一個重要的角色。ROC曲線分析還表明，這些核心節(jié)點基因可以區(qū)分非酒精性脂肪肝早晚期患者，雖然診斷準確度不是很高(AUC=0.621-0.719)。
　　在這些核心節(jié)點基因中，CACNA2D1，EPHA3，GINS1及GJA1在晚期NAFLD中表達上調(diào)，提示這些基因在晚期NAFLD中發(fā)揮著重要的作用。CACNA2D1編碼的蛋白屬于α-2蛋白亞族，α-2蛋白屬于電壓依賴型鈣離子通道復合體，CACNA2D1被報道同癲癇

12、、智力缺陷、肥胖及胰島功能亢進等臨床癥狀相關，而這些影響同時很有可能由GALK1的突變導致。EPHA3屬于酪氨酸激酶的肝配蛋白受體亞族。該基因的缺失被認為是潛在的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）的保護因素。EphA3蛋白主要位于細胞質(zhì)和細胞膜上，該蛋白的合成被認為同多種腫瘤相關。GINS1在DNA復制中發(fā)揮重要作用。GJA1基因突變主要是常染色體顯性遺傳疾病。對這些核心蛋白編碼

13、基因在非酒精性脂肪肝和健康樣本的表達水平進行分析，我們進一步計算晚期以及早期非酒精性脂肪性肝病與正常人群的差異表達基因。通過ROC曲線分析，我們進一步的分析了早期NAFLD蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡中的6個核心節(jié)點基因（EFHD1、GALK1、GCDH、SORL1、EPHA3和GINS2）的表達量。其中的4個基因（EFHD1、GALK1、GCDH和SORL1）具有符合統(tǒng)計學意義的AUC值，可以被用來提高早、晚期NAFLD患者診斷準確率。
　　

14、這些分析表明，EFHD1、GALK1、GCDH、MT1X、CACNA2D1、EPHA3、GINS1和GJA1是診斷早晚期非酒精性脂肪性肝病的潛在生物標記物。這些基因往往出現(xiàn)跨多個腫瘤相關疾病，如直腸癌、肺癌、前列腺癌、胃癌，以及膠質(zhì)母細胞瘤和肝癌，這表明他們可能在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，并可能在未來發(fā)展成為有效的診斷方法。
　　而在對肥胖患者同NAFLD患者基因表達譜的共同分析中發(fā)現(xiàn)，GCDH在肥胖患者