兩種茶樹內(nèi)源糖苷酶基因的表達(dá)、抗體制備及在不同品種中的差異表達(dá)研究.pdf

1、茶樹，我國重要的經(jīng)濟(jì)作物；茶，世界三大非酒精飲料之一，有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其香氣是影響茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要因素。茶香中主要的揮發(fā)性物質(zhì)單萜烯醇和芳香族醇等多以糖苷形式存在，且以櫻草糖苷和葡萄糖苷為主。研究表明，茶鮮葉經(jīng)物理損傷后，細(xì)胞分室被破壞，致使內(nèi)源糖苷酶與萜類香氣苷元發(fā)生酶促水解反應(yīng)，進(jìn)而釋放出香氣。β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶是茶葉中主要的內(nèi)源糖苷酶。
　　茶樹糖苷類香氣前體不僅是茶葉香氣形成的基礎(chǔ)，而且參與了茶樹對病蟲害

2、的防御。對于茶樹內(nèi)源糖苷酶已有相關(guān)報(bào)道，其克隆和表達(dá)工作也取得一定進(jìn)展，但茶樹中的β-櫻草糖苷酶（Pri）和β-葡萄糖苷酶（Glu）未能固化并用于生產(chǎn)，且至今未有商業(yè)化抗體出售，這對從蛋白水平上研究內(nèi)源糖苷酶造成了困難。
　　本文通過克隆并表達(dá)關(guān)鍵性的內(nèi)源糖苷酶，對內(nèi)源糖苷酶進(jìn)行多克隆抗體的制備和對不同茶樹品種中內(nèi)源糖苷酶基因表達(dá)差異分析，以及對茶葉萎凋過程中β-葡萄糖苷酶活性變化的研究等，以期達(dá)到如下目的：提高大家對茶葉香氣形成

3、機(jī)理的了解，為提高茶葉香氣品質(zhì)奠定基礎(chǔ)；為從蛋白水平上了解內(nèi)源糖苷酶的表達(dá)差異提供可能；為茶樹種質(zhì)鑒定提供分子標(biāo)記；為茶葉加工優(yōu)化提供一定的理論指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、根據(jù)本課題組從茶葉中分離純化的可水解葡萄糖苷類香氣前體的β-葡萄糖苷酶（Glu）的cDNA全長序列，和GenBank登陸的β-櫻草糖苷酶（Pri）基因序列，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物。通過RT-PCR擴(kuò)增獲得Glu和Pri基因片段，分別插入pET-32(+)和pMA

4、L-c5X中，成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a(+)-Pri/Glu、pMAL-c5X-Pri/Glu和去信號肽pMAL-c5X-Pri/Glu。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測后發(fā)現(xiàn)，pET-32a(+)-Pri/Glu得到高效表達(dá)，但以包涵體形式存在，未檢測到酶活性；pMAL-c5X-Pri/Glu未能表達(dá)；而去信號肽pMAL-c5X-Pri/Glu可在表達(dá)菌株BL21(DE3)中，經(jīng)1 mM IPTG，16℃，誘導(dǎo)20 h后可

5、溶性蛋白表達(dá)量最高，但未檢測到酶活性。
　　2、將pET-32a(+)-Pri/Glu載體表達(dá)產(chǎn)生的包涵體蛋白經(jīng) Ni-NTA親和層析柱純化，制備出Glu和 Pri多克隆抗體?？贵w經(jīng)ELISA與Western-blot檢測，效價(jià)為1∶100000，且具有特異性。通過抗體與茶樹種子總蛋白的特異性結(jié)合，表明β-櫻草糖苷酶也可能存在于茶樹種子中。
　　3、設(shè)計(jì)Glu真核表達(dá)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得Glu基因片段，插入pESC

6、-HIS，成功構(gòu)建表達(dá)載體pESC-HIS-Glu。經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析及Western-blot檢測表明蛋白得到表達(dá)。pNPG法酶活性檢測結(jié)果表明，該表達(dá)蛋白具有活性，活性為0.24±0.03 U。
　　4、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，研究了Pri、Glu兩個(gè)基因在13個(gè)茶樹品種中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在安徽7號及早逢春兩個(gè)品種中相對表達(dá)量均較高；香型較為突出的多抗香和悅茗香兩個(gè)品種中Pri

7、與Glu基因的表達(dá)量較高；大部分早生種中兩個(gè)基因的相對表達(dá)量高于中生種。
　　5、對室內(nèi)萎凋攤放0、2、4、6、8、10 h的五個(gè)茶樹品種葉片的含水量和β-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：萎凋時(shí)間造成的酶活性差異不顯著(P>0.05)，而品種對酶活性的差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。這表明不同品種間β-葡萄糖苷酶活性差異較大，品種的選擇對茶葉香氣的影響更為重要。萎凋過程中，含水量從80％降至52%左右，處于線性下降水平；