基于組合PCR的近緣物種鑒定方法的研究.pdf

1、不同物種在商品價(jià)值、品質(zhì)、潛在過敏原種類和受保護(hù)程度等方面存在較大的差異,因此亟需建立一種簡單、快速、可靠、重復(fù)性高的檢測方法來保障消費(fèi)者的權(quán)益、規(guī)范食品市場和保護(hù)瀕危物種。目前分子學(xué)鑒定方法能夠準(zhǔn)確的區(qū)分不同目、科的物種,但對(duì)于同屬的多個(gè)近緣物種的區(qū)分仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究改進(jìn)了傳統(tǒng)的物種特異性 PCR,設(shè)計(jì)多套中等特異性引物,通過綜合分析幾個(gè)PCR的結(jié)果來確定物種的身份。由中等特異性引物建立的多個(gè)PCR稱為組合PCR。本文建立的

2、組合PCR方法較傳統(tǒng)物種特異性PCR的優(yōu)勢在于:對(duì)序列高度相似的近緣物種設(shè)計(jì)只擴(kuò)增一個(gè)物種的引物是困難的,而組合 PCR對(duì)引物特異性要求較低即允許引物擴(kuò)增幾個(gè)物種,因此引物設(shè)計(jì)相對(duì)容易;傳統(tǒng)物種特異性PCR對(duì)假陰性、假陽性結(jié)果很敏感,而組合PCR中個(gè)別PCR結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果并不會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果有本質(zhì)的影響,仍然可以根據(jù)組合 PCR的結(jié)果判斷樣本的疑似身份;組合 PCR同時(shí)利用了多個(gè)目的片段,從多個(gè)角度反映樣品身份,比傳統(tǒng)的物種特異

3、性PCR準(zhǔn)確性更高;傳統(tǒng)PCR鑒別物種時(shí),所需的特異性引物數(shù)量一般等于甚至大于待區(qū)分物種的數(shù)量,而組合 PCR中由于各 PCR間交叉效果,其能夠用相對(duì)較少的反應(yīng)鑒別多個(gè)物種。本文選取金槍魚屬的所有金槍魚(7種)為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)中等特異性引物,建立組合 PCR方法,并驗(yàn)證了該方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。
　　首先,本文根據(jù)7種金槍魚在NCBI中的序列信息,針對(duì)編碼蛋白基因設(shè)計(jì)了6套中等特異性引物,并使用經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定的3種金槍魚(長鰭、黃

4、鰭、大目金槍魚)的多個(gè)個(gè)體探索引物特異性發(fā)揮的合適條件。理論上使用5個(gè) PCR反應(yīng)(共使用4套引物和3個(gè)反應(yīng)條件)即可對(duì)5種金槍魚身份進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分,可將另外2種金槍魚與其他金槍魚分開。
　　其次,根據(jù)一定條件下3種金槍魚種內(nèi)多個(gè)個(gè)體的PCR結(jié)果的一致性和對(duì)引物結(jié)合位點(diǎn)直接測序兩種方法,對(duì)引物種內(nèi)保守程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。兩種評(píng)價(jià)結(jié)果均表明:實(shí)驗(yàn)所用的4套引物種內(nèi)保守程度良好。雖少數(shù)個(gè)體的個(gè)別引物結(jié)合位置存在變異,但變異位于引物5端,對(duì)PC

5、R結(jié)果影響基本可以忽略。
　　再次,通過對(duì)真實(shí)樣品的序列測定,總結(jié)了在特定條件下引物真實(shí)的區(qū)分模板的能力。同時(shí)結(jié)合沒有實(shí)際樣品的金槍魚種的數(shù)據(jù)庫中信息,得出能夠鑒別7種金槍魚的組合PCR模型(共使用4套引物)。結(jié)果表明:4套引物針對(duì)7種金槍魚建立了6種組合PCR模型;長鰭和太平洋藍(lán)鰭金槍魚間序列的高度相似性,這兩種魚具有相同的PCR模型,本文針對(duì)金槍魚建立的組合PCR方法尚不能區(qū)分它們。
　　另外,本文利用上述方法鑒別市售的

6、金槍魚身份并對(duì)部分樣品(未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品)測序建立基因樹或SNP位點(diǎn)分析,結(jié)果表明:組合PCR鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定、其他分子學(xué)方法鑒定的結(jié)果一致,從而驗(yàn)證了組合 PCR結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性。
　　最后,本文建立了快速提取DNA的方法,所得DNA的完整性高。本文還對(duì)錯(cuò)配堿基種類、數(shù)目、聚合酶種類、引物模板比對(duì)引物區(qū)分能力的影響進(jìn)行簡單探索,這對(duì)組合 PCR引物設(shè)計(jì)和條件優(yōu)化有一定的參考價(jià)值。經(jīng)過優(yōu)化后的組合PCR方法更加簡單、快速。<