保加利亞乳桿菌代謝組學(xué)樣品的前處理研究.pdf

1、乳酸菌在食品工業(yè)中有悠久的歷史，已被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、青貯飼料、谷物和果蔬等的加工生產(chǎn)中，解析其生理代謝特性對(duì)于改善菌株的生產(chǎn)性狀具有重要的指導(dǎo)意義。研究其代謝組學(xué)需要可靠的、可重現(xiàn)的和全面的分析細(xì)胞內(nèi)具有較寬動(dòng)力學(xué)濃度范圍和化學(xué)功能各異的代謝產(chǎn)物，這就對(duì)從采樣、淬滅、代謝產(chǎn)物的提取到代謝物的定量分析這整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程提出了嚴(yán)格的要求。本研究以具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，構(gòu)建了小型快速取樣裝置，篩選了簡(jiǎn)單、快速的

2、評(píng)價(jià)淬滅時(shí)代謝物泄露的指標(biāo)，比較了三種淬滅液造成的代謝物泄露情況，并首次嘗試了冷熱結(jié)合提取法。該研究成果可為乳酸菌代謝組學(xué)的采樣、淬滅和提取研究提供理論依據(jù)，從而有助于完善乳酸菌代謝的生理學(xué)和遺傳學(xué)概貌。
　　 1、構(gòu)建代謝組學(xué)快速取樣裝置
　　 本研究構(gòu)建的自動(dòng)快速取樣裝置主要包括空氣壓縮機(jī)，三通電磁閥、微控制器和采樣管等。通過控制空氣的壓力和通氣時(shí)間，來調(diào)整采樣體積，采樣間隔時(shí)間可小于5s。同時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在收集

3、管內(nèi)裝有淬滅劑和干冰等冷卻劑，即可對(duì)進(jìn)入的生物樣本進(jìn)行即時(shí)淬滅和快速降溫。
　　 2、淬滅方法的比較分析
　　 本研究通過分析菌體細(xì)胞的完整性和胞內(nèi)代謝物的泄露率，評(píng)價(jià)了60％甲醇/水(-40℃)、80％甲醇/水(-40℃)和80％甲醇/甘油(-40℃)三種淬滅方式。由流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、OD回收率實(shí)驗(yàn)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種淬滅液都造成了胞內(nèi)代謝物泄露，但是高濃度的80％冷甲醇/水有助于減輕胞內(nèi)代謝物泄露的發(fā)生。

4、雖然甘油也可以減少胞內(nèi)代謝物的泄露，但因其難以被除去且掩蓋了很多其它的代謝物，并不適于GC-MS分析。另外，酶法檢測(cè)LDH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與整體趨勢(shì)相矛盾，推測(cè)LDH可能不適于作為評(píng)價(jià)代謝物泄露的科學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞完整性可以作為評(píng)價(jià)淬滅時(shí)代謝物泄露的簡(jiǎn)便指標(biāo)。
　　 3、提取方法的比較分析
　　 代謝組學(xué)提取要求最大程度和最大范圍的提取代謝物，從而真實(shí)的反映胞內(nèi)代謝情況。本研究比較了目前常用的冷甲醇液氮凍融法和熱乙醇提取法，并嘗試

5、了新的提取方法——冷熱結(jié)合提取法。通過GC-MS檢測(cè)和多元統(tǒng)計(jì)分析，包括PCA，OPLS-DA和差異代謝物，發(fā)現(xiàn)冷甲醇法提取氨基酸和短鏈有機(jī)酸類的效率優(yōu)于熱乙醇提取法，熱乙醇法提取長(zhǎng)鏈有機(jī)酸和糖類的效率優(yōu)于冷甲醇法，兩種提取方法各有自身的提取特點(diǎn)。而新的冷熱結(jié)合法在提取氨基酸、有機(jī)酸類和糖類等方面的效率介于冷甲醇提取法與熱乙醇提取法之間，提取其它類代謝物方面超越了冷甲醇液氮凍融和熱乙醇法，并保留了冷甲醇提取法和熱乙醇法的提取特點(diǎn)。從獲得